1、利用小鼠动物模型 研究基因表达与病理发育,郑耀武 转基因动物实验中心 综合实验楼205 85098583,转基因动物技术原理与应用,第一部分：常规转基因技术原理 第二部分：基因定位修饰技术原理 第三部分：CRISPR/Cas9技术原理与应用,第一部分,常规转基因动物原理与应用,什么是转基因？,狭义：人为将DNA片段插入基因组 广义：人为的对生物基因组的修饰，包括随机的基因片段插入，基因定位敲除，基因定位敲入，基因定点突变等,动物转基因的重要性,基础理论研究 （小鼠） 研究基因调节，包括启动子功能 基因功能追踪（Knockout，Gene Trap） 细胞追踪，如癌细胞转移（如EGFP基因敲入
2、） 基因表达与胚胎发育，器官发育 基因表达与生物学功能、病理发育 基因突变体表达功能研究 基因相互作用 应用研究 （大动物） 生产活性蛋白：酶，疫苗，抗体，生长因子，蛋白药（蛋白活性要求特异的翻译后修饰） 低生产成本：转基因动物可以传代，可以连续生产，如血浆蛋白，乳蛋白，比细胞培养成本低 病理动物模型，利用动物模型研究疾病发生机理、药效测试 器官移植：解决器官不足，重复感染问题，如猪肝脏 品种改良(GMO)：抗病，高产，营养价值提升 疾病治疗：治疗遗传缺陷，组织再生,转基因技术研究历史,第一个转基因小鼠：1974年 第一个小鼠干细胞：1981年 第一个基因捕获小鼠：1989年 第一个基因敲除小
3、鼠：1997年 第一个克隆动物：2008年 第一个CRISPR/CAS9小鼠,Rudolf Jaenisch in 1974. Jaenish successfully managed to insert foreign DNA into early-stage mouse embryo resulting mice carried modified gene in all their tissues and progeny.,Gossler, A., A. L. Joyner, et al. (1989). “Mouse embryonic stem cells and reporter c
4、onstructs to detect developmentally regulated genes.“ Science 244(4903): 463-5.,Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from ealry mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci (USA). 1981;78:7634-8.,Hooper M, Hardy K, Handyside A, Hunter S, M
5、onk M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 1987;326:292-5.,Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. Science. 2013 Feb 1
6、5;339(6121):819-23. doi: 10.1126/science.1231143. Epub 2013 Jan 3.,常见转基因技术,常规方法 ：受精卵细胞核DNA显微注射，随机插入，预见性低，但多样性 利用精子转染DNA，效率低，重复性差 利用转坐子进行DNA在基因组的插入，方法复杂，受限多 病毒感染：效率高，随机性低，可带DNA大小受限制，安全隐患，常用于大动物 干细胞胚胎显微注射：常用于小鼠基因定位修饰，预见性高，费时，大动物不成功 核移植动物克隆：大动物基因定位修饰唯一途径 CRISPR/Cas9技术：最新发展的，快速、简便、高效基因组修饰技术,真核基因结构与调节,真核
7、基因结构（cis element)：启动子(promoter)，外显子(exon)，内含子(intron)，polyA信号, 活化信号（enhancers), 沉默信号（silencers），封闭区(Insulators) 转录因子(trans element)(transcription factors)，活化因子(activators)，抑制因子(inhibitors) 真核mRNA结构：Cap，5非编码区(5-UT)，编码区(coding region)，3非编码区(3-UT)，polyA 组织专一性调节(tissue-specific regulation, spatial) 发育阶段
8、调节(developmental regulation, timingly) 诱导性调节(inducible) 转录后调节: mRNA剪接和修饰， mRNA的稳定性，蛋白质合成效率，蛋白质半衰期,基因结构图示,mRNA结构,基因转录复合体,转基因载体构建,启动子选取 cDNA 选取 Poly A 选用 内含子和封闭区 载体构建,启动子的类型和选取,特异启动子：研究基因调节（lacZ），启动子功能，调节其它基因表达。 用于其它基因表达，一定要查询启动子在转基因动物应用文献，了解启动子完整性 高表达启动子选用：用于高表达某个基因，高表达蛋白生产 广谱启动子应用：显示基因细胞标记（EGFP） 可诱导
9、启动子的应用：用于基因调节，有毒蛋白表达，致命基因的调控 复合启动子：可诱导、高表达、组织专一基因调节系统，用于调节基因或高表达蛋白,表达基因（cDNA）的类别,显示基因(reporters): lacZ, GFP, CAT, AP等 调节基因: Cre, ER-Cre, tTA, tTR,PTX等 蛋白质功能研究：蛋白突变体的表达 基因剪接：研究外显子、内含子功能 商业基因：药用蛋白，改良基因等 生理功能基因: 基因治疗，干细胞移植等 非编码基因：非编码RNA功能研究，siRNA基因沉默, CRISPR/Cas9 gRNA基因组修饰 抗性基因：细胞筛选,其它转基因载体构件选取,poly A
10、：提供稳定的mRNA 常用poly A: SV40 poly A, -Globin poly A 内含子选用：第一个内含子，如-Globin 内含子 封闭区应用：增加表达几率，减少对周围或被周围基因影响 Loxp, FRT, tetO序列,基因A启动子,典型转基因结构（Heterologous）,CCAAT box,TATA box,Enhancer,转录起始点,基因B cDNA,翻译起始点,基因C polyA,5-UT,3-UT,拼接区域：,转基因动物（Founders）鉴定,检测转基因在基因组插入： PCR Southern 拷贝数：Southern, Real time PCR 插入位点
11、：Inverse PCR mRNA表达： In Situ RT-PCR Northern 蛋白表达： 显示基因：酶活性分析lacZ，Luciferase，AP, 荧光EGFP, RFP 功能分析： 结构变化：石蜡切片，H&E染色 免疫组织化学、免疫荧光定位：冰冻切片，抗体染色 免疫沉淀：Western,小鼠生物学基础及转基因优越性,小鼠免疫力强，繁殖率高，体型小，为经济有效动物模型 小鼠遗传表型多样，全基因组序列解析，经典哺乳类实验动物模型 多种自交系 孕期1921天 性成熟时间：母45周，雄5-6周 母鼠发情周期5天左右 成鼠体重：20-50克 母鼠平均产子56窝，自交系每窝6-8只，远交系
12、10-14只,产生转基因鼠标准条件和要求,洁净动物房，高蛋白，高脂肪饲料（Breeder chows) 供卵鼠：4-6周杂交子一代母鼠(C57B6xCBA or DBA),每次10-12只，每周两次 种鼠：年龄两月到一年的杂交子一代雄鼠(C57B6xCBA or DBA) 20-24只 代孕母鼠：每次见栓2-5只，2-6月高繁殖率母鼠(CD1)50-100只 结扎公鼠： (C57B6xCBA or DBA)子一代或 (CD1)雄鼠，各需求10-20只，适用年龄2-18月,转基因小鼠具体操作过程,构建载体，纯化DNA片段，去除原核载体序列 促排卵激素超排卵，合笼，分离E0.5 受精卵 DNA显微
13、注射 胚胎培养过夜 胚胎回移代孕鼠 切尾鉴定 传代杂交 表达分析,性成熟,供体受精卵收集，每次100200个供体受精卵细胞核DNA显微注射浓度: 2-5ng/ul受精卵回移代孕母鼠: 每只移植20-30个左右双细胞卵PCR或Southern 筛选转基因鼠(founders), 15-50%, 随机插入，拷贝数1-100第一代下传（F1) 0-100%，有卵裂后插入或两个以上的插入位点第二带下传，蒙德尔遗传，50表达功能分析：从E10到5个月,转基因鼠产生相关的数据,转基因常见问题,启动子不完整，造成基因不表达或错误表达 DNA插入随机性造成不表达、低表达、鼠系间差异 封闭区(insulater
14、s)序列 基因高表达毒性，得不到转基因鼠或不表达 第一个内含子重要性 转基因片段的大小： 2kb到1000kb 大部分2-10kb,容易注射 P1质粒(PAC),70kb左右，黏度大 细菌人工染色体BAC，120kb左右， 黏度更大 酵母人工染色体YAC，500kb-1000kb，非常难注射 同时注射两个以上的转基因：效率高，一般插入同一位点 多拷贝插入方式：头尾相接 拷贝数与表达水平：无紧密关联，多数拷贝被甲基化，转录因子浓度限制 其它因素：DNA浓度(2-3ng/ul)，酒精、嗅化乙锭和EDTA残留 载体骨架DNA对转基因表达影响：原核序列不稳定 C57/BL6纯系转基因鼠受精卵注射：效率
15、略低,转基因动物原理及应用,第一部分：常规动物转基因技术原理 第二部分：基因定位修饰技术原理 第三部分：CRISPR/Cas9技术原理与应用,第二部分：基因定位修饰,基因定位修饰原理 基因定位修饰过程 基因定位修饰应用,基因定位修饰重要性,基因功能研究：随着基因组解析，基因敲除和基因定位修饰进行基因功能解析 基因调节：可以人为控制基因位点准确修饰，基因调节更为精确，研究结果更确定，病理模型更有价值 基因修饰稳定性，低拷贝，对基因组影响小，表达特定蛋白，大动物克隆，抗体基因组置换 基因治疗：准确定位修饰，结合人类干细胞培养和CRISPR/Cas9技术，是将来基因治疗(Gene Therapy)、
16、组织再生(Regeneration Medicine) 重要途径,小鼠早期发育示意图,3.5天,干细胞特性,祖细胞 (projenitor cells)的特性 可以分化成少数不同种类细胞的原性细胞，可以进行有限次数的不等分裂 干细胞(stem cell)的特性 可以分化成多种组织器官、不断增殖的少数细胞 胚胎干细胞(ES)具有全能性 每个细胞可以发育分化成任何组织器官、个体 小鼠胚胎干细胞来源： 囊胚内细胞群(ICM) 来源种系：多数129SV/jae, 少数 C57/BL6 毛色：棕色(129), 黑色(C57/BL6) 性别：雄性干细胞更稳定,Gene Trap (基因捕获）,源于小鼠干细
17、胞全能性的发现 标示基因高通量小鼠基因组随机插入，基因分析 利用无启动子标示基因表达框，前端有内含子/外显子剪接信号，后面有PolyA，中间有抗性基因 随机插入内含子后会剪接成融合表达蛋白，标示基因表达 原基因位点失活 公数据共平台库： International Gene Trap Consortium is centralizing data and cell lines can be requested from them.,基因定位修饰载体类型,简单基因敲除载体构建原理 条件性敲除载体构建原理 点突变 显示基因敲入 组织专一基因位点敲入（LacZ, EGFP），研究基因表达 广谱lox
18、p敲入，与调节基因Cre结合，进行组织特异性敲除,NEO,1,3,TK,X,X,1,NEO,3,载体,重组后,基因敲除载体设计原理,NEO,TK,FRT,FRT,loxP,loxP,野生型,载体,用Flipase去NEO,FRT,CRE杂交 失活基因,loxP,FRT,条件性敲除载体构建原理,Gene targeting in embryonic stem cells has become the principal technology for manipulation of the mouse genome, offering unrivalled accuracy in allele d
19、esign and access to conditional mutagenesis. To bring these advantages to the wider research community, large-scale mouse knockout programmes are producing a permanent resource of targeted mutations in all protein-coding genes. Here we report the establishment of a high-throughput gene-targeting pip
20、eline for the generation of reporter-tagged, conditional alleles. Computational allele design, 96-well modular vector construction and high-efficiency gene-targeting strategies have been combined to mutate genes on an unprecedented scale. So far, more than 12,000 vectors and 9,000 conditional target
21、ed alleles have been produced in highly germline-competent C57BL/6N embryonic stem cells. High-throughput genome engineering highlighted by this study is broadly applicable to rat and human stem cells and provides a foundation for future genome-wide efforts aimed at deciphering the function of all g
22、enes encoded by the mammalian genome.,基因定位修饰过程,干细胞分离、培养，多用固定细胞系 基因定位修饰载体构建 干细胞转染和重组克隆筛选 干细胞囊胚显微注射 嵌合体产生与传代 杂合体产生 纯合体产生 基因功能的分析,利用小鼠干细胞进行基因打靶过程,嵌合体的传代杂交,嵌合体（Founders） ES 均来源于129 鼠系，为棕色 (agouti) C57BL6 囊胚为黑色(black) ES注入后，毛色可以预测干细胞并入比例 40-100%雄性嵌合体与C57/BL6母鼠交配 6周左右与两只 C57 母鼠杂交，每周换一次母鼠 棕色为显性，如果连续六窝全黑，放弃
23、嵌合鼠,输卵管移植,子宫移植,代孕鼠,电击筛选,囊胚注射,转基因和基因定位修饰过程的比较,Founder的产生,传代，分析,受精卵细胞显微核注射,转基因与基因打靶比较,第三部分,基因定位修饰进展 CRISPR/Cas9技术原理 利用CRISPR/Cas9技术 研究生理、病理发育,DNA随机突变（化学诱变，放射线诱变） 转基因技术（DNA片段基因组随机插入） 小鼠全能干细胞发现和应用（基因捕获） 基因打靶（DNA重组基因定位修饰） 锌指核酸酶ZNF（基因组定位切割修饰） TALEN（基因组定位切割修饰） CRIPSR-Cas9（基因组定位切割修饰）,基因组修饰历史,利用ZFN 技术进行基因组修饰
24、,2000早期，研究者开发了锌指核酸酶（ZFN）技术, 首次利用人工构建DNA序列特异核酸酶，对基因组进行识别、切割和修饰 锌指酶发源于转录因子结构，类似于转录因子，具有两个结构域： 人工设计DNA-binding zinc-finger protein (ZFP) domain FokI DNA nuclease domain DNA识别域由3-6个Cys2-His2锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白区结合3-5方向DNA链上特异三联体碱基以及5-3方向的一个碱基 ZFN以二聚体结合到靶位点上，相距5-7个碱基，通过两个FokI核酸酶切割靶位点 由于信息有限，设计复杂，有多达60种的锌指库，设计
25、完美的锌指核酸酶要花费很长时间,ZFN工作原理,利用TALEN技术进行基因组修饰,Transcription activator-like effector nucleases (TALENs),TALENs 同样包括两个结构域，一个是DNA Binding，另一个是 FokI nucleaseTranscription activator-like effectors (TALEs) 为3335 amino acid repeats,每一个repeat识别一个碱基对，由中间的第12和13氨基酸决定，称为 repeat variable diresidues (RVDs). 最常用的四组为 A
26、sn-Asn, Asn-Ile, His-Asp and Asn-Gly，分别识别 G, A, C 和T四个碱基。,TALEN 工作原理,CRISPR/Cas9 发现与应用进展,最初发现于bacteria or archaea，由protospacers 和 direct repeat 序列顺序排列，可以转录成crRNA 和 tracrRNA两种小RNA。 Protospacers，DNA fragments (20 bp)，来源于噬菌体或质粒，相间于direct repeat，统称为 CRISPR。 两个小RNA与CRISPR-associated protein 9 (Cas9)一起，具有
27、 DNA特异序列 endonuclease活性，识别和切割外源DNA、RNA，行使免疫保护功能。 crRNA and tracrRNA 可以通过DNA转录成single-chain guide RNA (sgRNA)，同样具有CRISPR功能。,Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR),CRISPRCas9工作原理,常用表达系统 Available Expression Cassette,常用质粒px330,PAM 序列出现频率,设计简单 效率高 特异性强 一次性多位点修饰 适用于各种生物 用途广,CRI
28、SPRCas9系统优势,CRISPRCas9技术应用,Cas9蛋白和导向RNA共转染人细胞基因组修饰 1）核定位Cas9 蛋白 2）U6启动子带动的一个或多个导向RNA 3）导向RNA紧跟着正确的PAM序列 4）任何GN20NGG均可为靶点,3 gene, 6 locus targeting efficiency,Nickase工作原理,Cas9突变，细菌筛选不同PAM序列 增加了特异性 发现更多的Cas9变异型具有更好的特异性 发现更小的Cas9变异型 说明还有挖掘潜力和改进的空间,Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71. doi: 10.1016/j.cell.20
29、15.09.038. Epub 2015 Sep 25.Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System.Zetsche B1, Gootenberg JS2, Abudayyeh OO3, Slaymaker IM3, Makarova KS4, Essletzbichler P3, Volz SE3, Joung J3, van der Oost J5, Regev A6, Koonin EV4, Zhang F7.Abstract The microbial adaptive immune sy
30、stem CRISPR mediates defense against foreign genetic elements through two classes of RNA-guided nuclease effectors. Class 1 effectors utilize multi-protein complexes, whereas class 2 effectors rely on single-component effector proteins such as the well-characterized Cas9. Here, we report characteriz
31、ation of Cpf1, a putative class 2 CRISPR effector. We demonstrate that Cpf1 mediates robust DNA interference with features distinct from Cas9. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease lacking tracrRNA, and it utilizes a T-rich protospacer-adjacent motif. Moreover, Cpf1 cleaves DNA via a staggered DN
32、A double-stranded break. Out of 16 Cpf1-family proteins, we identified two candidate enzymes from Acidaminococcus and Lachnospiraceae, with efficient genome-editing activity in human cells. Identifying this mechanism of interference broadens our understanding of CRISPR-Cas systems and advances their
33、 genome editing applications.,Feng Zhang labs Target Finder Identifies gRNA target sequences from an input sequence and checks for off-target binding. Currently supports: Drosophila, Arabidopsis, zebrafish, C. elegans, mouse, human, rat, rabbit, pig, possum, chicken, dog, mosquito, and stickleback.M
34、ichael Boutros labs Target Finder (E-CRISP) Identifies gRNA target sequences from an input sequence and checks for off-target binding. Currently supports: Drosophila, Arabidopsis, zebrafish, C. elegans , mouse, human, rat, yeast, frog, Brachypodium distachyon, Oryza sativa, Oryzias latipesRGEN Tools
35、: Cas-OFFinder Identifies gRNA target sequences from an input sequence and checks for off-target binding. Currently supports: Drosophila, Arabidopsis, zebrafish, C. elegans , mouse, human, rat, cow, dog, pig, Thale cress, rice (Oryza sativa), tomato, corn, monkey (macaca mulatta).CasFinder: Flexible
36、 algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes Identifies gRNA target sequences from an input sequence, checks for off-target binding and can work for S. pyogenes, S. thermophilus or N. meningitidis Cas9 PAMs. Currently supports: mouse and human.,gRNA 免费设计软件网站,ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9总结比较,
37、利用Crispr-Cas9技术建立 自闭症小鼠模型,直接敲除模型 LacZ敲入模型,Dip2A为自闭症潜在相关基因之一,Poelmans, G., et al. (2009). “Identification of novel dyslexia candidate genes through the analysis of a chromosomal deletion.“ Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 150B(1): 140-147.,Dip2A基因组序列缺失的阅读障碍家系,成功敲除整个基因（65Kb ） 受精卵注射敲除效率： 23.1% 干细胞
38、打靶敲除效率： 39%,利用CRISPR- Cas9系统进行 Dip2A-LacZ 敲入模型,Dip2A LacZ Knock-in,胚胎发育期Dip2A表达分析,成年期Dip2A脑部表达分析,系统进一步优化，PAM序列多样化 高通量基因序列功能分析 Inducible Cas9 mouse 重复序列功能分析 人类疾病动物模型 器官移植，免疫排斥基因的敲除 品种改良 药物开发 动物抗体基因人源化 基因治疗 遗传缺陷修复 基因表达水平校正,基因组修饰前景,思考题,简述常规动物转基因原理和方法 简述基因定位修饰原理 简述基因定位修饰类型和方法 简述常规转基因和基因定位修饰的不同及各自的优越性 简述CRISPR/Cas9技术原理 简述CRISPR/Cas9技术可应用范围,
