1、BD多色流式全面解决方案,BD生物科学Judy,Identification of immune cell subsets by eightcolor antibody staining,Nat Rev Immunol,2012,Nat Rev Immunol, 2012,Eightcolor antibody panels proposed by the Human Immunophenotyping Consortium,多色方案中荧光素选择的重要性荧光素同抗原的搭配优化仪器配置，提高分辨率多色Panel设计实例分析,主要内容,流式多色方案中荧光素选择的重要性,V450,BV510,BV4
2、21,BV605,CD4,CD3,合适的荧光素选择帮助我们更好的理解实验 对于弱的抗原，亮的染料尤为重要,荧光素的选择是关键,荧光素的选择是关键,CD3,BV421,V450,FITC,PerCP-Cy5.5,PE,PE-CF594,Alexa Fluor 647,Alexa Fluor 700,CD197 (CCR7),选择正确的荧光素组合是回答生物学问题的关键,荧光素分辨率等级,等级由细胞经不同克隆，不同规格的抗体在多种流式细胞仪上的实验所得的染色指数（分辨率）的比较决定 激光器的能量，PMT电压，光学部件，抗体克隆和生物样品等多种因素均会影响荧光素/试剂在某个特定仪器上的效果,基于仪器配
3、置选择荧光素,BD Horizon Brilliant Violet,六种被紫激光激发的染料 基础多聚体: BV421 and BV510 串联体: BV605, BV650, BV711 and BV786 亮的染料 减少交叉激光激发 减少样品制备影响,与其他染料的比较,BV421,BV711,BV650,PE,BV CD4 试剂与PE比较,Buffer Compatibility Surface Stain,Buffer compatibility : intracellular staining,Unstimulated,CMV pp65,CD4,CD8,IFN-g PE,IFN-g P
4、E,SEB,紫激光配置,检测光学部件需匹配所用的荧光素许多仪器已经配置可以使用纳米晶体染料为最大限度地发挥BD Horizon Brilliant Violet 的组合优势，仪器可能需要更新配置更新配置可提高扩展仪器的性能,BD Horizon Brilliant Ultraviolet (BUV),两种被355nm紫外激光激发的新荧光素 BUV395: 对其他检测其几乎无溢漏 BUV737: 对Alexa Fluor 700中等溢漏,BUV395 中等亮度 Exmax/Emmax: 348 nm/395 nm 滤光片: 379/28BP,BUV737 明亮 Exmax/Emmax: 348
5、nm/737 nm 滤光片: 740/35BP; 690LP,与其他染料的比较,BV421,PE,FITC,BUV395,BUV737,BUV CD4 试剂与 PE, BV421 和 FITC 比较,BD Horizon Brilliant Blue (BB515),Brightness: Very Bright Ex Max 490 nm Em Max 515nm Filter: Same as FITC (e.g. 530/30 nm),BB515 is up to seven times brighter than FITC,Hu CD4 Hu CD3,Ms CD11b Hu CD19
6、Hu CD127,Better resolution of dim markers,CD25 FITC or CD25 BB515 and CD3 PerCP-Cy5.5, CD4 APC, CD127 PE,CD25 FITC,CD25 BB515,荧光素同抗原的搭配,理解抗原表达的特性 选择最合适荧光素偶联的抗体,三大类: Primary: 很好鉴定，容易区分阴阳性细胞群，阴阳性峰分得很开 Examples: CD3, CD4, CD45Secondary: 很好鉴定，较高水平表达，经常连续性表达 Examples: CD27, CD28, CD45RA, CD45ROTertiary:
7、低水平表达，激活性marker，或者表达区分不明显 Example: CD25,抗原的分类,Mahnke YD, Roederer M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 2007; 27:469-485.,在表达最低密度的抗原上匹配最亮的荧光素 抗原密度一定是在细胞亚群水平上确定的 这个规则会由于通道间相互溢漏，共表达等原因有所改变 抗原密度也会由于激活状态而有所改变,抗原密度列表,抗原和荧光素的组合,high,low,medium,抗原共表达,Marker的共表达： Population resol
8、ution is impacted by spillover. 细胞群的分辨率会受到通道溢漏的影响 Markers co-expressed on specific cell types should be conjugated to spectrally separated fluorochromes. 在特定细胞亚群共表达的marker应该偶联光谱分离的荧光素T 细胞panel中-可能用到的marker: CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD27, CCR7, CD25, CD127,优化仪器配置，提高分辨率,分辨率的重要性 优化仪器设置：CS&T 荧光溢漏,分辨率,分辨率
9、流式细胞仪区分弱染色信号和未染色信号的程度 在多色情景下更为复杂,清晰分群的能力取决于背景和阴性群体的分散度。,分辨率 vs. 背景,阴性群体背景高，不能清晰分群。,阴性群体背景低但分散度（相对标准偏差）大，不能清晰分群。,染色指数: 分辨率的度量标准,阴性群体的宽度取决于 仪器性能 检测效率, 背景荧光和电子噪音 单色 溢漏 多色方案,亮度取决于 试剂 抗原密度，所用荧光素 仪器 通道电压增益，激光器能量,流式细胞仪设置和跟踪(CS&T)系统,CS&T是一个由软件（FACSDiva 和 FACSuite）和试剂（CST微球）整合而成的完整系统。 CS&T 系统的作用 确定决定仪器性能，影响灵
10、敏度/群体分辨率的因素 相对荧光检测效率 (Qr) 相对光学背景 (Br) 系统电子背景噪音 (SDen) 标准化仪器设置 应用设置 跟踪仪器性能,CS&T 系统的益处,科学家/使用者 从多色实验中得到高质量的数据 每天提供稳定并可重复的数据 根据实验条件优化仪器设置 提供每次实验时仪器状态的参数平台负责人/操作者 尽早发现仪器性能的下降 帮助确定问题的来源 提供设置仪器的信息（系统电子背景噪音）,仪器设置 优化 PMT电压使弱荧光细胞的分辨率最大化,阴性细胞标准偏差法 调整PMT电压使得这种方法简单容易，对所有检测器提供更稳定的值 用未经染色的细胞,CS&T 设置 对每个参数，设置PMT电压
11、值使弱荧光微球的平均荧光强度等同于10倍的电子噪音 这是CS&T设置目标MFI值的PMT电压 对大多数参数适用，但对紫激光(V450, BV421)和远红外激光 (APC-Cy7, PE-Cy7) 通道电压倾向于将电压设置得过高,调整PMT电压以使分辨率 (SI)最大化,rSD is 2.5 SDen (20),FITC 检测器 (SDen = 20),将电压从373升高至473后，该检测器的分辨率（染色指数）得到显著提高，变为原来的2.6倍,将电压从473升至573后，阳性和阴性细胞的荧光强度得到同等程度的增强，对分辨率没有明显改进,约473 V是理想的PMT电压设置值，其阴性细胞的相对标准
12、偏差 （rSD）大于电子噪音（SDen）的2.5倍,荧光溢漏,荧光溢漏的重要性,多色方案群体分辨率 为了使感兴趣的群体获得最好的分辨率，荧光溢漏是方案设计时唯一最为重要的因素。复杂数据的可视性 不正确或欠佳的溢漏值计算会对实验所得的数据质量产生负面的影响。,荧光溢漏到其他检测器导致背景及信号分散，影响分辨率,荧光溢漏到其他检测器：比如PerCP-Cy5.5溢漏到PE-Cy7的检测器,荧光溢漏导致： 背景信号(MFI)增强,信号分散/分散度（rSD）,PE-Cy7,PerCP-Cy5.5,当样品经过正确地补偿后，被溢漏的检测器所检测到的阳性群体和阴性群体的平均荧光强度是相等的。,然而，溢漏所致的
13、信号分散（rSD）及因此引起的分辨率降低并不能被补偿所消除。,将溢漏所致的背景扣除的过程称为补偿。,单色对照,计算溢漏值的工具,补偿对照 微球,补偿微球的优势 易用 不需要细胞 对于多数荧光素，所得的补偿值与细胞所得的一致,多色Panel设计实例分析,For Research Use Only. Not for use in diagnostic or therapeutic procedures. APC-Cy7: US Patent 5,714,386 Alexa Fluor is a registered trademark of Life Technologies Corporatio
14、n. CF is a trademark of Biotium, Inc. Cy is a trademark of GE Healthcare. Cy dyes are subject to proprietary rights of GE Healthcare and Carnegie Mellon University and are made and sold under license from GE Healthcare only for research and in vitro diagnostic use. Any other use requires a commercia
15、l sublicense from GE Healthcare, 800 Centennial Avenue, Piscataway, NJ 08855-1327, USA. BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company. 2014 BD 23-16447-00,依据 机器性能 (光路配置) 分析中的生物学内在关系 (目的细胞群，抗原密度和共表达) 选择的荧光素优先顺序 (荧光亮度和通道间溢漏) 应用逻辑规则分配荧光素给特异性抗体,多色实验Panel设计实例分析,6色Treg
16、细胞配色实例,举例1-遵循规则 根据抗原表达分配荧光素的原则来优化panel举例2-最好的实践 进一步优化panel使Treg的分辨率最大化 抗原密度&共表达 荧光素的亮度 由于通道间溢漏导致的分散程度,6色Treg细胞配色实例,双激光6色,Fluorochrome,抗原密度和荧光素亮度匹配,PE,APC,PE-Cy7,FITC,PerCP-Cy5.5,APC-Cy7,CD25,CD127,CD45RA,CD4,CD8,CD3,Specificity,ANTIGEN,ASSIGNMENT,Laser,荧光染料的强度与抗原表达水平相匹配 低密度表达抗原需要更亮的荧光素 荧光染料之间的重叠最小 避
17、免偶联染料带来的假阳性,优化Panel设计来提高Treg的分辨率,通过 分配PerCP-Cy5.5给CD8来减少PerCP-Cy5.5溢漏到PE-Cy7通道的影响,CD8 APC-H7,CD4 PerCP-Cy5.5,CD127 PE-Cy7,CD25 PE,CD3 FITC,CD45RA APC,CD8 PerCP-Cy5.5,CD4 APC-H7,CD127 Alexa Fluor 647,CD25 PE,CD3 FITC,CD45RA PE-Cy7,通过分散CD25和CD127到不同激光管和选择最小溢漏荧光素来提高Treg分辨率,6色T细胞Panel: 举例2,优化panel后使荧光通道
18、溢漏最小化,FITC CD3 PE CD25 PerCP-Cy5.5 CD8 PE-Cy7 CD45RA Alexa Fluor 647 CD127 APC-Cy7 CD4,SSC,CD3 FITC,CD25 PE,CD8 PerCP-Cy5.5,CD4 APC-Cy7,CD127 Alexa Fluor 647,CD45RA PE-Cy7,CD25 PE,6色Panel中例1，例2结果比较,1st Example,2nd Example,例2中CD127和CD25的分辨率都得到提高例2中比较容易对Treg圈门,CD127 PE-Cy7,CD127 Alexa Fluor 647,CD45RA
19、 PE-Cy7,CD45RA APC,8色T细胞Panel设计,8色T细胞Panel设计 2个不同方案,Expanding the 6-color panel to an 8-color panel,从已有的6色panel开始，在拓展的机器配置上添加marker优化6色方案按照多色panel设计的原则，根据机器配置建立特异性的8色方案,Scenario #1,Scenario #2,方案1: 6色Panel优化到8色Panel,CD3 CD4 CD8CD25 CD127CD45RA CCR7 CD27,FITC APC-Cy7 PerCP-Cy5.5PE APCPE-Cy7 BV421 BV5
20、10,紫激光可得BV421 and BV510: 2个最亮的荧光素 亮度和少的溢漏允许被添加进panel然而6色panel并没有考虑添加更多marker，因此对于8色panel来说，并不是最佳的 添加了2个新的marker，但整个panel并没有遵循panel设计的原则,方案1,SSC,CD3 FITC,CD27 BV510,CD8 PerCP-Cy5.5,CD4 APC-Cy7,CD25 PE,CD45RA PE-Cy7,CD27 BV510,CCR7 BV421,CD45RA PE-Cy7,CCR7 BV421,CD127 Alexa Fluor 647,Fluorochrome,Spec
21、ificity,ASSIGNMENT,Laser,方案2: 按照3激光配置优化最佳8色方案,SSC,CD3 BV510,CD27 PE,CD45RA FITC,CCR7 BV421,CD8 PerCP-Cy5.5,CD4 APC-Cy7,CD127 Alexa Fluor 647,CD25 PE-Cy7,CD27 PE,CD45RA FITC,CCR7 BV421,方案2: 按照3激光配置优化最佳8色方案,8-Color Panels: 例1和例2中的补偿,1st: Using Existing 6-Color Panel,CD25 PE,CD45RA FITC,CD127 Alexa 647
22、,CD25 PE-Cy7,CCR7 BV421,CD45RA PE-Cy7,CCR7 BV421,2nd: Building From Scratch,CD45RA FITC,CD45RA FITC,CD27 PE,CCR7 BV421,CD27 BV510,CCR7 BV421,CD45RA PE-Cy7,CD45RA PE-Cy7,CD25 PE gives slightly better resolution than CD25 PE-Cy7.,CD45RA negatives have significant less spread in scenario 2.,Better CD27
23、 resolution in scenario 2.,CD127 Alexa 647,拓展8色panel到11色panel,CCR4, CD95, CD122是非常重要的对于鉴定新的Treg亚群，我们想尽可能解决这个问题 在8色panel设计策略的基础上添加新的marker，荧光素的分配显得很容易 我们做了如下分配，尽量挑选亮的荧光素，其中有的荧光素只有很小的溢漏，是不同的激光管激发的 CCR4 APC, CD95 PE-Cy7, CD122 BV421,添加Treg marker到这个panel中,11色Panel: 拓展新的panel后，Effector/Memory Marker 分辨率
24、没有改变,8-color panel built for drop-ins,11-color: 8 Color + Treg drop-ins,CD27 BV510,CD45RA AF700,CCR7 PE-CF594 (YG),CD27 BV510,CD45RA AF700,CCR7 PE-CF594 (YG),CD27 BV510,CCR7 PE-CF594 (YG),CD27 BV510,CD45RA AF700,CCR7 PE-CF594 (YG),CD45RA AF700,根据panel设计的规则得到最佳数据 根据机器配置选择荧光素 对抗原进行分类，在表达特性基础上分配荧光素 优化机器配置和补偿 Panel设计是一个反复的过程 决定一个panel是否是最佳的唯一办法是和相关对照一起上机检测,总结,多色流式方案设计,让可得更多，可见更清晰 多色流式 Thank you judy_,
