1、第三篇 实验部分 第7章 配制试剂和缓冲液 第8章 贮藏和处理 第9章 无菌操作技术,第七章 配制试剂和缓冲液,Logo,确定所需之物,配制试剂与缓冲液,1,计算所需之物,2,稀释储备的缓冲液,3,称量和混合,4,测定pH值,5,缓冲液和溶液的储存,溶液灭菌,6,7,一、确定所需之物,1.熟读整个试验程序,写下所需要用到的试剂。 2.确定每一种试剂你要配制多少。 3.确定配制直接使用的溶液还是配制高浓度的储备液。 4.确认需要的化学试剂可以在实验室里找到。 5.如果没有库存应尽快获得药品。,安全性,1.清楚你所接触的每一个药品的组分及相关毒性 2.遵照建议处理（手套 眼睛保护 橱罩 面罩 标签
2、） 3.知道如何使用通风橱,常见有害试剂,丙烯酰胺 神经毒性，用于蛋白质电泳凝胶和测序凝 胶的制备，要戴面罩。 溴化乙锭 EtBr是一种诱变剂，能嵌入DNA，用于核酸标记。有毒，固体可以刺激皮肤和黏膜。 酚 强腐蚀性，可以灼伤皮肤，萃取和配制时应使用通风橱。 苯甲基磺酰氟（PMSF）分离蛋白质时用于对蛋白水解酶的抑制，吞咽或通过皮肤吸收都有可能致命 十二烷基硫酸钠（SDS）去垢剂，易燃，尤其对于鼻腔刺激性强，SDS质地光滑蓬松，称量时要动作要轻盈和戴面罩。,水质分类,塑料和玻璃器皿,用于混合的玻璃器皿烧杯 三角烧瓶 试管 容量瓶 不能用于混合的玻璃器皿量筒 储存缓冲液的玻璃器皿带线纹盖的玻璃瓶
3、 细胞培养液玻璃瓶 细口瓶 不适合用于缓冲液储存的器皿广口烧瓶 琥珀色容器 线纹盖子封口不严密,二、计算所需之物,1.计算物质的量浓度 2.当量浓度（N）1L水溶液中溶解的溶质的用氢的当量物除摩尔质量 3.质量分数溶液质量体积分数（W/V）体积分数 (V/V)质量/质量分数 (W/W),三、稀释储备的缓冲液,连续稀释,制备酚和酚氯仿,酚 无色透明，可直接用于分子克隆。（注意：强腐蚀性，会灼伤皮肤，应带口罩、护目镜，穿防护衣，在通风橱内进行。） 平衡酚 使用前，必须将酚平衡到PH7.8，因为DNA在酸性条件下会进入有机相。 酚：氯仿：异戊醇 （25:24:1） 含等量酚-氯仿-异戊醇的混合物常在
4、抽提核酸的实验中使用，以除去蛋白质。氯仿能够使蛋白质变性，且有助于水相和有机相分离，异戊醇可以减少萃取过程中产生的泡沫。,四.称量和混合,准备所需称量纸称量器皿刮刀、药匙干净的量筒烧杯或三角烧瓶磁力搅拌器和搅拌子处置药匙和磁力搅拌子的地方擦拭纸蒸馏水,称量,1.称量时戴上手套。 2.阅读瓶上的标签。（是否戴面罩） 3.打开天平电源。 4.称量纸及称量器的重量。 5.称量材料。（能放回药品瓶中多余的药品：该物质没有吸湿性；除了干净的称量纸及称量器，没有接触过其他物品。） 6.药品倒入烧杯或三角烧瓶中。 7.紧紧该上药品瓶盖。 8.称量结束，打扫天平。（不能马上加水的药品，用铝箔或者塑料纸盖住烧杯
5、口，做上标记，放到自己的试验台上。）,混合：（对于多数溶液）,1.加入终体积约80%的水到烧杯中，然后加固体溶质。 2.轻轻放入磁力搅拌子，确保能有足够空间自由转动。 3.先把烧杯放在磁力搅拌器上，打开低速搅拌开关，缓 慢调大转速。 4.待溶质充分溶解后停止搅拌。 5.把溶解完全的溶液倒入量筒或烧杯中，测定体积，加溶剂使整个溶液的体积接近所需体积的90%。 6.将溶液倒回烧杯或三角瓶中，调pH值。 7.在烧杯上标记好内容物。,五、测定pH值,校准PH计 至少两种PH标准溶液（通常使用PH4和10的标准 液。） 34个50ml的玻璃或塑料药品杯 棉纸,校准PH计,1.将电极从浸泡缓冲液中拿出，用
6、蒸馏水冲洗，用棉纸巾小心擦干电极外面的液体。 2.倒出约1.5英寸的PH4（或10）的标准溶液，倒在小烧杯中，盖上瓶盖，把电极头浸入烧杯的溶液中。 3.按下PH计上的“标准化”按钮，直到仪器上显示稳定的PH为4。 4.按下“待命”按钮，拿出电极清洗干净并擦干。 5.把PH10的溶液倒入另外的烧杯中，用同样方法标定。 6.标定后清洗擦干，把电极插回保存液中保存。 7.测定标准化缓冲液的PH。,测定PH,1.在磁力搅拌器上搅拌准备调PH的溶液。 2.将电极从保存液中取出，用蒸馏水冲洗干净，棉纸擦干，PH计的状态应保持在“待命”。 3.把电极头进入需测定的溶液中，并确定搅拌子不会碰撞到电极。 4.将
7、PH计上的转换开关从“待命”转到“PH测定”。 5.读取数值，并用 NaOH或HCl进行调节。 6.将PH计的功能调回到“待命”。 7.将电极拿出，用蒸馏水冲洗干净并用棉纸擦干。 8.将电极浸入储存缓冲液。 9.把调好PH的溶液倒入量筒或容量瓶，定容。 10.把定容的溶液倒入有盖的玻璃瓶或塑料瓶中密封。 11.在瓶子上贴上标签，灭菌。,六、溶液灭菌,高压灭菌 大多数缓冲液，不明确的细菌和酵母培养基。 不能高压灭菌 含有去垢剂的缓冲液，如10%SDS，会因沸腾溢出。 有机溶剂，包括酚。 含有热不稳定的成分，如血清、维生素、抗体、 BSA 等蛋白质。 哺乳动物、植物和昆虫的培养基。 含HEPES的
8、溶液。含有DTT二硫苏糖醇或BME的溶液。,高压灭菌,1.将待灭菌器材、试剂放入高压蒸锅内，装液体的瓶中液体不能超过2/3，盖紧盖子后松动一圈，或用铝箔纸包紧； 2.高压灭菌开始时，先打开排气口，待热水蒸气排出数分钟后，关闭阀门灭菌，调温，20分钟。待压力降到0后放气； 3.灭菌后，让瓶子冷却，并及时扭紧瓶盖； 4.可以将高压蒸锅盖留一条缝，在加热至100度，冷却后高压蒸锅内的器材也自动烘干了。 5. 一般器材开15-20分钟即可，液体30分钟。,高压灭菌,注意： 1有时装液体的瓶子可能破裂，可将瓶子放在钢制托盘中，防止瓶子一旦破裂时，试剂流入高压锅内。 2高压灭菌全过程中，应有专人看护。 3
9、强酸、强碱、挥发性液体、爆炸性物质不能开蒸锅。,过滤除菌,用于热不稳定的、易挥发的或体积小于20ml的溶液。利用重力、加压或真空的方法，使溶液通过孔径足够小的膜除去微生物。0.2微米的滤膜缓冲液和一般培养基 0.1微米的滤膜组织培养的培养基,七、缓冲液和溶液的储存,培养液应该在4储存。 缓冲液可以在4或者室温储存。 浓度高的溶液室温保存。 光敏感试剂应该在适宜的温度下在棕色瓶中储存，或放在盒子里的瓶内保存，瓶外裹上铝箔保存也可以。,第八章 贮藏和处理,Logo,紧急贮藏,1,储存试剂,2,分装,3,冰箱和冷库,4,实验室废物的处理,5,贮藏和处理,紧急贮藏,紧急贮藏,紧急贮藏,储存试剂,储存试
10、剂的须知储存和丢弃须知的获取怎样保存需要干贮的试剂如何储存光敏感试剂如何储存氧敏感试剂,储存试剂的须知,相关的危害：注意试剂是否是放射性同位素、易燃、剧毒或挥发性的。 试剂必须按照储存要求存放。,储存和丢弃须知的获取,物质安全资料表（MSDS） Merck手册 环境健康与安全部门部 在因特网上搜索,怎样保存需要干贮的试剂,容器 容器必须能盖紧，内部有放干燥剂的空间。对于一些试剂，广口瓶是最好的。对于更大的瓶子来说，玻璃或塑料的干燥器是必需的。干燥器有不同的形状、大小和材料，应该首先考虑大小。性质活泼的试剂需要真空保存，任何用于厌气培养细菌的容器也需要真空润滑剂。干燥剂 干燥剂通常是蓝色或紫色粗
11、糙的碳酸钙小圆球，或是相类似的圆球。干燥剂一般装在袋子、桶或是有孔的罐子里。干燥剂也可以用于气体的干燥，但大多数实验室并不采用。,干燥器,PC-3塑料真空干燥器,玻璃干燥器,如何储存光敏感试剂,棕色瓶或琥珀色瓶储存，或者用铝箔包好。 管装试剂可以放在盒子中，可冻存或运输的盒子最适合。将常规信息贴在盒子上，如“内有光敏感试剂”，但是光敏感试剂应是盒子中的唯一试剂，不要在盒子中到处寻找其他试剂。 常见的光敏感试剂有放线菌素D、丝裂菌素C、氮蓝四唑(NBT)、酚、利福霉素和四环素。,如何储存氧敏感试剂,氮气瓶必须放在化学通风橱的附近，因为通常有机溶剂的溶液需要氮气，使用时打开通风橱。 确定氮气瓶用带
12、子固定住。 将巴氏管插入和压力调节器相连的管子中。 打开氮气，将流量调节到将管子靠近手背也几乎感觉不到为止。 在通风橱中打开试管或瓶子，试管和瓶子应妥善的放置在架子上。 将巴氏管的尖端放入容器口至能看到液体表面有波浪，保持5-10秒，较高的液体-气体比例需更长的时间。 迅速盖上容器。 关掉氮气。 保存瓶子，通常保存在-20，也可以保存在真空。,分装,为什么要分装 什么时候不用分装 如何分装,为什么要分装,防止储存液反复冻融造成的降解 避免多次使用造成的污染 空间上方便 节省时间,什么时候不用分装,稀释的物质不稳定 不常用的物质 使用不同浓度或浓度变化范围较大的物质,如何分装,配制储备液须知：
13、物质的工作浓度 在什么溶剂中溶解物质 分装的体积 决定配成几倍。 准备好无菌的管子，做好标签。如果要分装的物质必须冷藏，就把管子置于冰上。 配制浓溶液，如果需要，过滤。 把配好的无菌溶液分装到试管,存放在冷藏库或者是合适温度的架子上。 在记录本上做好记录。,冰箱和冷库,使用适当的冰箱或冷藏库 只有在取试剂的时候才打开冰箱门 冰箱或冷藏库内所有容器都必须有标签 定期清理那些已经不用的试剂 把所有试剂放置的位置记录下来 尊重私人空间,怎样除霜,除霜工作应该提前一个星期做计划 除霜前的清理是丢弃无用试剂的好时机 仔细地把所有试管包好 除霜要在上午尽可能早的时候开始 戴好手套除冰 备好任何可以吸水的东
14、西，还有放置丢弃吸水物的盆 除霜 用吹风机加速除霜 除去所有产生的水 保持地面干燥 把除过霜的冰箱擦干净 等到冰箱完全干了才能插上电源 记录试剂的放置位置,实验室废物的处理,实验室废物处理须知：化学组成 有危害还是无危害 是否有放射性 是否有生物危害 是否可以回收利用,处理的优先顺序,放射性，固体； 放射性，液体； 化学危害废物； 生物危害废物； 尖利物品； 无害的化学物品。,第九章 无菌技术操作,Logo,何时使用无菌技术,1,无菌技术,2,保护实验人员,3,无菌技术操作,什么时候使用无菌技术,当必须进行无菌操作时无论什么时候在进行活的有机体实验或是为进行活体实验二准备培养基、缓冲液、培养容
15、器等时，必须使用无菌操作技术，例如： 准备转化用的大肠杆菌培养物 制备LB平板培养基 分装细胞 过滤培养基的血清 打开和溶解冻细胞,什么时候使用无菌技术,在无菌操作有帮助的情况下 限制性酶切反应：虽然大部分酶被保存在甘油中，而且甘油浓度大于50%时通常不会长菌，但是在稀释酶和进行没有甘油参与的操作时存在潜在污染的可能性，而且微量的常见元素的污染也会抑制酶的活性。 进行PCR反应：进行PCR反应时要防止外源性DNA等的污染，避免造成酶活性和特异性降低。 利用32P磷酸盐标记细胞：使用无菌技术是出于对自身的保护，而不是出于保护细胞。出于无菌考虑，不应让盖子一直敞开，不能让气雾产生以及不要使用已经用
16、过的移液管。,无菌技术,规则 工作区域尽可能地远离通风口和交通口 确保整洁的工作环境 实验前用消毒剂或清洁剂清洁工作区域 所有用到的移液管和试剂瓶都必须是无菌的 工作区间内尽量减少手臂的运动 把所有可能用到的东西都准备好 戴好乳胶手套并及时更换,技术技巧,最小化 保持试剂瓶与桌面成大约45角时打开盖子 若必须取下盖子，则要把它倒放在干净的台面上 使用玻璃的移液管及打开试剂瓶时都要用火烧一下 塑料的试剂瓶和移液管不能用火烧 轻轻地吸取液体，不要旋转试剂瓶 不要让试剂瓶保持开口状态 停下你手中的工作,移液 使用可重复使用的玻璃移液管 使用一次性移液管 过滤除菌 用注射式过滤器过滤少量溶液 使用杯状
17、滤器过滤大体积的溶液 抽气操作,保护实验人员,生物安全水平的要求 生物安全橱 生物安全橱是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。更侧重于保护操作人员和环境，防止操作的病原微生物扩散造成人员伤害和环境污染。,根据生物安全防护水平的差异，生物安全橱可分为一级、二级和三级三种类型。,生物安全橱,在生物防护橱中进行无菌操作,1.确认通风橱已经打开并且空气正在循环。 2.把框格降低到刻度处。 3.不要阻碍空气流通。 4.小心不要把碎纸和其他轻小的物体吸入排气管道内。 5.每次实验前用70的乙醇或异丙醇等其他消毒剂擦拭桌面。 6.实验中如果必须拿下盖子，把盖子倒放在干净的表面上。 7.尽量减少手臂在通风橱内晃来晃去。 8.生物安全橱内不要使用火焰灯。,有礼貌地使用生物安全橱,遵守橱上张贴的注意事项和提醒。 尽可能快的使用通风橱。 自觉补充那些快用完的公用试剂，如70乙醇等。 及时清理实验垃圾，不要让它们从垃圾箱中溢出来。 用完通风橱后清理内部。,致 谢,
