1、1高效液相色谱法同时测定染发剂中 13 种染料【摘要】目的: 建立染发剂中13种染料的HPLC测定方法。方法: 样品经乙醇- 水超声提取后, 过滤后进样检测。以磷酸盐缓冲液- 乙腈为流动相梯度洗脱, 流速1 m l/m in, 检测波长为203 nm。【关键词】 染发剂；染料；高效液相色谱分析【高效液相色谱法】高效液相色谱法 【1】 是20世纪70年代发展起来的一项高效、快速的分离分析技术。液相色谱是指流动相为液体的色谱技术。在经典的色谱法基础上，引入了气相色谱法的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。这种柱色谱技术称作高效液相色谱法
2、。它可以用来进行液固吸附、液液分配、离子交换和空间排阻色谱分析，应用非常广泛。主要特点有高压、高速、高效和高灵敏度。对于高沸点，热稳定性差，相对分子质量大（大于400以上）的有机物原则上都可用高效液相色谱法来进行分离、分析。【分离原理】1.液液分配色谱法。流动相与固定相都是液体。试样溶于流动相后，在色谱柱内经过分界面进入固定相中，由于试样组成在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分配。组分分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大，但流动相的种类对分配系数有较大的影响。2.液固色谱法。流动相为液体，固定相为吸附剂。各组分根据物质吸附作用不同来进行分离。3.
3、离子对色谱法是将一种或多种与溶质分子电荷相反的离子加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。4.离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶2质离子进行可逆交换，根据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。【染发剂】染发作为美容方式之一, 近年来消费人群不断扩大。城市中青少年彩色染发者逐年增多, 同时中老年人群中染发者比例也呈上升趋势 .【2】染发剂是一类含有染料的化妆品。目前染发剂的分类方式有多种, 根据其染色后的牢固程度，染发剂可分为暂时性、半永久性和永久性三类。其中永久性染发剂染发原料又可分为氧化染料、还
4、原染料和仿天然黑素染料。其中氧化型染发剂最受欢迎, 占到市场份额的80%. 【3】 氧化染料是合成染料中最早用于毛发染色的，也是目前应用最广泛的持久性染发剂原料。氧化型染发剂以其染色效果好、色调变化宽、维持时间长等诸多优点而成为最受欢迎的染发剂。但氧化型染发剂主要由氧化型染料和氧化剂组成。染发剂中的染料成分多属于芳香胺类化合物，芳香胺中有很多物质具有致癌性，所以染发剂的安全性一直受到人们的极大关注。由染发剂引起的过敏反应非常普遍，长期使用还可能致畸、致突变、致癌及引起内分泌效应等。根据卫生部监督司资料, 目前我国批准生产的染发剂以每年数十种的速度上升 【4】 。因此, 加强对染发剂的卫生管理和
5、日常监督非常必要。为了加强对该类产品中氧化型染料的监管，中华人民共和国卫生部颁布的化妆品卫生规范(2007年版)明确规定了93种暂时允许使用的染发剂，并规定了限量要求。 【5】 通过试验, 本实验建立了以磷酸盐缓冲液- 乙腈为流动相, 用高效液相色谱法测定染发剂中13种染料( 包括1 种禁用染料)的方法, 并用于实际样品的测定, 该方法操作简便、快速、准确、重复性好。【材料与方法】31.仪器与试剂W ate rs2695高效液相色谱仪, 色谱工作站, W a ters2996 二极管阵列检测器( PDA ), 超声波清洗器, 水浴锅, 0. 45 m 滤膜。乙腈(色谱纯); KH 2 PO4
6、( AR); Na2HPO4 ( AR ); 庚烷磺酸钠( AR) ; 亚硫酸钠( AR) ; 乙醇( AR) ; 高纯水。p- 苯二胺( p - phenylened iam ine )、p - 氨基苯酚( p -am inopheno1) 、氢醌( p- hydroquinone) 、甲苯- 2, 5- 二胺硫酸盐( 2, 5- diam inoto luene sulfate )、m - 氨基苯酚( m - am inophe no1)、4- 氨基间甲酚( 4- am ino- m - creso l)、o- 苯二胺( ophenylened iam ine) 、间苯二酚( m - d
7、ihydroxybenzene)、4- 甲氨基苯酚硫酸盐( 4- me thy lam inopheno l sulfa te)、N, N- 二甲基对苯二胺( N, N- diethy l- p- pheny lened iam ine) 、5- 氨基邻甲酚( 5- am ino- o- creso l)、6- 氨基间甲酚 ( 6- am ino- m - cre so l)、对氨基二乙基苯胺硫酸盐( N, N - diethy l- p- phenylene diam ine su lfate)等13种染料标准品购于美国Sigma公司。2.标准溶液的配制称取各染料对照品约50 mg (精确至
8、0. 01 m g) , 置于50 m l容量瓶中, 95%乙醇溶解并定容至, 分别配成约1 mg /m l的染料单标储备液。因在95%乙醇中溶解性较差, 甲苯- 2, 5-二胺硫酸盐、4- 甲氨基苯酚硫酸盐及对氨基二乙基苯胺硫酸盐直接用纯水溶解定容。各染料的单标储备液保存于4 冰箱中, 存储期限为2 d。用移液器移取各单标储备液适量至25 m l容量瓶中, 用95%乙醇+ 水(体积比为1+ 1)稀释至所需浓度。43.样品前处理精密称取样品0. 5 g, 用95%乙醇定容至25 m ,l 超声提取15 m in, 以14000 r /m in离心10 m in, 上清液用 0. 45 m 微孔
9、滤膜过滤后待测。4.色谱条件色谱柱为Phenom enex Cl8 ( 4. 60 250 mm, 5 m ); 流动相为乙腈/磷酸盐缓冲液( pH = 6. 0); 磷酸盐缓冲液( pH = 6. 0)的配制: 称取庚烷磺酸钠0. 1000 g、磷酸二氢钾0. 3098 g和磷酸氢二钠 0. 0882 g溶于1 L水中, 混匀, 配制成含0. 01%庚烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液, 并用磷酸调节pH 至6. 0。0. 45 m微孔滤膜过滤后使用。流速: 1. 0 m l/m in;柱温: 30 ; 检测波长: 203 nm。梯度洗脱程序见表1。5.标准曲线绘制用染料混合标准溶液配制线性范围内5个点
10、的标准(见表2), 在设定色谱条件下, 分别取样 5微升注入W aters2695高效液相色谱进行分析, 以标准系列质5量浓度( g/m l) 为横坐标, 峰面积为纵坐标, 绘制各染料峰面积和浓度的标准曲线。6.样品测定及计算取处理好的样品滤液5L注入W aters2695高效液相色谱进行分析, 与标准试剂进行峰面积的对比后, 得出相应的浓度值, 进行计算：6式中: X 为样品中染料的含量( g / g ), 是由线性回归方程计算得到的测定液中染料的含量( g /m l), V为样品稀释的体积 ( m l), m 为样品的质量( g )。【结果与讨论】1. 流动相的选择根据推荐方法 610 ,
11、 本文分别以磷酸盐缓冲液/乙腈为流动相和以三乙醇胺水溶液/ 乙腈为流动相测定了这 13种染料 , 结果表明, 以三乙醇胺水溶液/乙腈为流动相时, 13种染料不能完全基线分离, 并且第一个出峰的组分p- 苯二胺保留时间过短, 在做样品时有一定的干扰, 不能到达测定要求。而以磷酸盐缓冲液/ 乙腈为流动相 , 则完全满足分离要求。在实验中, 作者发现磷酸盐缓冲液的pH 对分离度影响较大, 分别比较了pH 为5. 0 、 5. 5、6. 0 、6. 5时的色谱图, pH = 6. 0时的色谱图分离度最好。另外, 磷酸盐缓冲液的浓度虽然对分离效果的影响并不大, 但是由于过高浓度的磷酸盐在梯度洗脱的时候,
12、 容易在高比例的乙腈中析出, 故推荐在满足分析要求的情况下尽量采用低浓度的磷酸盐。加入离子对试剂庚烷磺酸钠对改善峰型和分离度也有较大贡献。标准谱图见图1, 样品谱图见图2。2. 波长选择通过测定染料的单标和混标, 经全程扫描计分析, 13种染料的最佳吸收波长分布在191. 1 nm 202. 8 nm, 考虑到低波长对检测基线的影响, 故选择203 nm 作为检测波长。73.色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间对13种组分的分离至关重要, 如果采用“专柱专用”的用柱方式, 平衡时间仅用30 m in即可, 否则大约需要1 h的平衡时间。3. 精密度及加标回收率用样品分别做13种染料的加标回收和精密度实
13、验, 结果见表3。85各种染料线性范围及检出限用染料混合标准溶液配制线性范围内的5个点的标准( 见表2) , 在设定色谱条件下, 分别取样5 L注入高效液相色谱分析 , 以标准峰面积对其质量浓度做线性回归。以3倍信噪比计算检出限。 13种染料的标准曲线的回归方程及检出限见表4。6.提取条件的选择甲苯- 2, 5- 二胺硫酸盐、4 - 甲氨基苯酚硫酸盐、对氨基二乙基苯胺硫酸盐等染料可能以盐的形式存在于样品中, 为确保在样品中能够提取完全, 本9文用乙醇: 水为1：1 为提取液和稀释液, 乙醇- 水能有效提高提取效率并提高进样试液与流动相的混和性。7.样品测定利用本法测定了28 种市售染发剂样品。
14、其中配方已知的18种样品共使用了15种染料成分, 用本方法可检出其中的p- 苯二胺、p- 氨基苯酚、氢醌、m - 氨基苯酚、4 - 氨基间甲酚、间苯二酚、N, N - 二甲基对苯二胺、5- 氨基邻甲酚、6- 氨基间甲酚共 9种染料成分。通过比较这18个有含量标识样品的值10与配方值之间的相对误差, 评价定量结果的准确度。结果表明, 18 个样品所含成分含量测定值与配方值均符合, 相误差小于20%; 对于配方未知的10个样品, 根据保留时间和紫外光谱图检索结果, 找出可能的染料成分, 同时根据峰面积进行定量。结果在这10个样品中共检出5- 氨基邻甲酚、m- 氨基苯酚、p- 氨基苯酚、p- 苯二胺
15、、间苯二酚、4 - 氨基间甲酚、6- 氨基间甲酚、N, N - 二甲基对苯二胺等8种染料成分。其中o- 苯二胺均为检出。样品检测结果见表5。【参考文献】11【1】 王骏，胡俊明.高效液相色谱法测定化妆品中的染料J.色谱，1999,17：486.【2】 徐燕英, 童建. 氧化性染发剂毒性研究进展 J . 环境与职业医学,2004,10, 21( 5 ): 403- 404.【3】 朱会卷, 杨艳伟, 张卫强, 等. 染发剂中14 种染料成分的液相色谱测定法 J. 环境与健康杂志, 2008, 25( 8) : 722.【4】 徐燕英, 童建. 氧化性染发剂毒性研究进展 J . 环境与职业医学,2
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