1、高熹 168615140001 2016 年 10 月 17 日人体性染色质体的观察实验报告一、实验目的1、掌握人体性染色质的检测方法； 2、观察人体性染色质的形态特征及存在部位；为进一步研究人体染色体的畸变与疾病提供参考条件；3、了解雌性哺乳动物 X 染色体失活假说和剂量补偿效应的机制。二、背景知识二十世纪六十年代，M.L.Barr 等研究发现雌猫神经细胞核膜内凝缩的深染小体性染色质体(sex-chromatin body)或巴氏小体(Barr body)，而雄性个体细胞中则没有。进一步研究发现：所有哺乳类雌体细胞中都可以见到这一结构。此后研究发现这种与性别有关的两型现象在有袋类、食肉类和灵
2、长类等动物的多数组织细胞中存在，而在啮齿类中在少数组织中可以观察到。三、实验原理在雌性个体的细胞中的 2 条染色体，在间期，有一条呈松散状态，参加细胞生理活动；另一条保持异固缩状态，我们称之为 Barr小体。由于 Barr 小体是处于失活状态，所以一般位于细胞核内边缘。形状多样（微凸形、三角形、卵形、短棒形等） 。一般，在正常女性细胞中可能出现一个 Barr 小体，正常男性细胞中不可能出现 Barr 小体；（正常女性口腔粘膜细胞中约 3050%有一个 Barr 小体。在不同实验室中计数的差别较大，而在男性中则高熹 168615140001 2016 年 10 月 17 日仅只偶尔可见不典型者这
3、是环境引起代谢的暂时现象，约 2%以下） 。对于性染色体畸变的个体。 Barr 小体数 = 细胞内 X 染色体数1。Barr 小体特征及位置：它是处于失活状态的 X 染色体，一般位于细胞核膜内侧边缘的一个深染区（较细胞核要小） ，形状多样。剂量补偿效应：是指 XY 型性别决定的生物，由 X 染色体上的基因决定的性状在两性的表现几乎相同。即 X 染色体上的基因的表达产物在雌、雄细胞中是等量的。 哺乳动物 X 染色体随机失活或父源 X 染色体失活有袋动物 父源 X 染色体失活黑腹果蝇 雄性个体 X 染色体基因表达水平加倍秀丽线虫 雌性个体两条 X 染色体基因表达水平减半补偿的实现途径： X 染色体
4、转录速率的差异性，雄性细胞中的X 染色体转录速率雌性细胞中 2 条 X 染色体的转录速率；雌性细胞中有一条染色体失活。四、实验器材、材料和试剂1、器材：生物显微镜、镊子、漱口杯、牙签、载玻片、盖玻片、染色缸、解剖针。2、实验材料：实验者的口腔黏膜或带有毛囊的头发。3、试剂：50%，70%，95%乙醇、二甲苯、5mol/LHCL、1%硫堇水溶液、蒸馏水、封固剂、乙醚、醋酸地衣红燃料或 45%乙酸。高熹 168615140001 2016 年 10 月 17 日五、实验步骤1、取材1）口腔黏膜材料载玻片用去污剂彻底清洗，蒸馏水彻底冲洗后再经过 70%乙醇冲洗，在火焰上烘干保存备用。以防操作过程中上
5、皮细胞脱落。取材前，自来水漱口三次，去除口腔中的细菌和已经退化的黏膜上皮细胞。防止口腔中的细菌被硫堇溶液染色与细胞发生混淆。取材时，张开嘴，用牙签轻轻刮面颊内壁，将挂下来的细胞在绝对结晶的载玻片上涂成一个占较大面积的薄层，空气中干燥30min 后进行染色。2）毛囊材料取发根细胞：拔取一根带有毛囊的头发，置于载玻片上，滴加固定液于毛囊上，固定 1min 左右，空气干燥。2、染色1）口腔黏膜材料将涂片依次放入 95%、70%、50%乙醇和蒸馏水的染色缸中，每种浓度的溶液浸泡 2min。涂片自蒸馏水中取出后，放入 5mol/LHCL 染色缸中，大约 5s。将酸解的涂片放入蒸馏水的染色缸中 10-15
6、s 去算，最好重复一至两次，PH 会影响染色效果。在 1%的硫堇水溶液染色缸处理 10-15min。染色后经蒸馏水洗后一次在下列酒精溶液中脱水：50%乙醇 30s，70%乙醇 30s，95%乙醇高熹 168615140001 2016 年 10 月 17 日30s，无水乙醇 30s。在二甲苯中透明 1min，然后取出多余的二甲苯。2）发根细胞去下毛囊，弃发干，加一滴醋酸地衣红染液后盖上盖玻片，然后文火微热，静置 5min 后盖一滤纸压片。或者在材料上滴一滴 45%乙酸或 5mol/LHCL 解离 5min 后吸掉多余乙酸。用洁净的解剖针针头将毛囊的组织分散均匀，待晾干后将载玻片放入硫堇溶液中染
7、色 20min。取出载玻片移入 75%乙醇中作用 30s。取出载玻片晾干待镜检。六、实验结果及分析高熹 168615140001 2016 年 10 月 17 日1、镜检制片时，先用低倍镜找到细胞，再用高倍镜观察并计数性染色质体。应该注意核质是网状或细颗粒状分布；核膜清晰、核无缺损；染色适度；周围无杂菌。2、性染色质体位于核膜的内验，应为深蓝色，直径大于 1um。在口腔黏膜上皮细胞中很难辨认非边缘 X 染色质体。3、性染色质体偶尔也在雄性细胞中观察到，概率很小。七、注意事项1、刮口腔上皮细胞前要漱口。2、涂片略干再加改良苯酚口红。3、染色时间不要太长，否则核质着色深，X 染色质体不易区分。高熹
8、 168615140001 2016 年 10 月 17 日4、毛囊细胞要充分解离，压片前可先用解剖针敲片，使细胞解离。八、思考题1、掌握概念：巴氏小体、性染色质、X 小体、剂量补偿效应。巴氏小体：在哺乳动物体细胞核中，除一条 X 染色体外，其余的 X 染色体常浓缩成染色较深的染色质体，此即为巴氏小体。又称X 小体，通常位于间期核膜边缘。性染色质：性染色质指高等哺乳动物体细胞核内的一种可被碱性染料染成深色的小体，性染色质检查可初筛性染色体病及鉴别性别，对两性畸形可辅助诊断。X 小体：紧贴细胞核膜内面的团块状结构，直径约 1um，染色程度较其他染色质深。剂量补偿效应：使细胞核中具有两份或两份以上
9、基因的个体和只有一份基因的个体出现相同表型的遗传效应。一个细胞核中某一基因的数目称为基因剂量。在以性染色体决定性别的动物中，常染色体上的基因剂量并无差别，因为雌雄两性动物的常染色体的形态和数目都相同。但是对于性染色体来讲，包括人类在内的哺乳动物雌性个体的每一体细胞中有两条 X 染色体，所以在 X 染色体上的基因剂量有两份，而雄性个体只有一条 X 染色体，基因剂量只有一份。2、查阅文献指出巴氏小体研究的新进展。羊水脱落细胞巴氏小体探究文献记载口腔黏膜细胞中， 巴氏小体百分率男性5%，18%女性高熹 168615140001 2016 年 10 月 17 日42%。本试验结果中男胎巴氏小体3%有
10、22 例， 8%女胎36%有 15 例，女胎巴氏小体明显低于文献，从表中可以看出男女巴氏小体百分率仍呈现出明显分界线，说明羊水脱落细胞巴氏小体与胎儿性别密切相关3，准确率达 92.5%，只是与口腔黏膜细胞判断标准不一样。尤其两者中间出现的 3%巴氏小体8%过渡值，其间男胎女胎均有，此区间不可以作为判断的依据。出现以上差异，有可能与实验对象及材料不同有关，其次镜检者的实际经验，对可数细胞的认定不一样，也可出现差异，口腔间期细胞较多，羊水脱落细胞退化程度较高，间期细胞相对较少，也是出现差异的因素。染色方法的不同也会有百分率的不同，胎儿染色体本身有可能异常5以至于出现羊水脱落细胞巴氏小体男女百分率与口腔黏膜细胞巴氏小体百分率的不一致。此外可运用孕妇血浆中胎儿游离 DNA 进行无创伤性产前基因诊断对此结论进行认证。3、绘制巴氏小体的图片。
