1、质粒DNA的提取、定量、与PCR鉴定,王妮莎,一、实验流程,简述实验内容流程，PCR操作步骤 煮菌，PCR（PCR程序最后设4保温）约2小时收集PCR产物 学习PCR原理 质粒DNA提取（约1小时） 紫外检测定量知识（计算方法），步骤 紫外检测定量 琼脂糖电泳原理 电泳（样品：质粒DNA，PCR产物，酶切产物，Marker）约30分钟 观察电泳结果、记录、拍照、保存,二、实验目的,掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理和测定方法 学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小 掌握PCR基因扩增的原理和操作方法,聚合酶链式反应(PCR)Polym
2、erase Chain Reaction,仪器: PCR仪(BioRad MJ mini) 台式离心机 灭菌的薄壁离心管 微量加样枪 凝胶电泳系统等 凝胶成像系统,一、实验仪器,1、 菌液：DNA模板 大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD19-T),二、实验材料,抑癌基因,2、引物： 正向引物： 5 GTA AAA CGA CGG CCA GT 3反向引物: 5 CAG GAA ACA GCT ATG AC3 3、2Premix ：Taq酶：5U/l 4dNTP: 10mM each10buffer: 500mM KCl , 100mM Tris-HCl (pH 8.3)MgCl
3、2: 25mM 4、灭菌去离子水,二、实验材料, 94预变性2 分钟后开始以下循环 94 30 秒55 30 秒 30 循环72 60 秒 72 8 分钟； 4 保温。 实验过程约1小时30分钟,三、实验步骤,DNA变性 形成2条单链,DNA单链 与引物复性,子链延伸 DNA加倍,菌液煮沸10min 2、取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头,且PCR反应管标记在侧面)：,如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心或者将反应管盖上盖子使劲甩，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上。,四
4、、结果分析,1、用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定; 2、加5uLPCR产物进行电泳; 3、预期PCR产物大小约400500bp;,* 由1985年穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。,五、实验原理,PCR 反应系统的组成,模板DNA引物dNTP耐热的 DNA聚合酶缓冲液,(一)模板DNA PCR 可以以 DNA 或 RNA 为模板进行核酸的体外扩增。 模板的浓度要适当基因组
5、DNA：50-100 ng质粒DNA: 5-10 ng,模板DNA,(二)引物与摸板DNA链互补的小片段DNA分子；作为DNA复制的起始点， 即与目的片段互补的一段寡核苷酸链。PCR特异性反应的关键；,引物的特异性：引物的设计与合成对 PCR 的成功与否起着决定性的作用 引物的浓度：引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性 引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成 一般认为 PCR 反应中引物的终浓度为 0.2 1mol/L 为宜 引物的设计：使用引物设计软件Oligo 6, Primer premier, NTI 9.0, Omiga, Dnastar等,引物的
6、设计原则：,1. 长度 一般为1530 bp 2. GC含量 一般为4060 3. 引物二聚体（1）不应有自身互补序列（2）两个引物之间不应有多于4个碱基的互补 4. 引物修饰 5端可修饰，3端不能进行修饰 5. 同源性 与非特异结合区同源性不超过70 6、Tm值 高于55,（三）Taq 酶 从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的热稳定性 DNA 聚合酶 酶浓度：酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增 每 100l 反应液中含 1-2.5U Taq DNA 聚合酶为佳 保存：-20 ,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,Taq
7、 DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90,10080604020,（四）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,（五） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游
8、离的Mg2+浓度。,变性温度与时间,变性充分：变性温度越高，时间越长变性就越充分。 变性温度、时间要适应：温度过高、时间过长又会影响 Taq DNA 聚合酶的活性， 变性温度90-95 为宜。,退火温度与时间：,复性温度决定着 PCR 的特异性。温度越低复性越好， 升高复性温度可以增加非特异性结合，大多数 PCR 反应的 复性温度在 3570,一般低于引物Tm值的5左右。 复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。,引物延伸温度一般为 72 。 延伸时间：72 时，核苷酸的合成速度为 35-100 个核苷酸 /S ，这取决于缓冲体系、 pH 、盐浓度和 DNA 模板的性质。 然
9、而，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。,延伸温度与时间：,PCR循环次数 循环次数要恰当：一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。 常规PCR循环次数一般为2540个周期。,PCR相关技术,荧光定量PCR（real-time PCR）,PCR相关技术,融汇PCR技术、DNA探针杂交技术（标记有荧光报告基团与荧光淬灭基团），结合先进的光谱检测技术发展起来的一项新技术，通过测定荧光强度来对PCR产物进行实时定量。,PCR相关技术,优点：起始定量,PCR技术的主要用途,（一）目的基因的克隆 （二）基因
10、突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA的序列测定 （五）基因的突变分析,PCR的临床应用,遗传病的诊断：-地中海贫血诊断、产前诊断、肝癌研究、-1抗胰蛋白酶缺陷症、苯丙酮尿症、痛风病等诊断研究 生物识别：PCR已用于人免疫缺陷病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（HPV）等十几种病毒检测 癌基因的研究：选择肿瘤基因突变部位进行扩增，可协助对肿瘤的诊断。,质粒DNA的提取与定量 Extraction and Quantitation of Plasmid DNA,一、什么是质粒？,独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子； 基因工程常采用的载体,质粒提取方
11、法,方法：碱裂解法煮沸裂解羟基磷灰石柱层析法酸酚法等。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理选择哪一种方法主要取决于以下几个因素： 质粒的大小 大肠杆菌菌株 裂解后用于纯化的技术和实验要求,基本步骤,所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：1)培养细菌使质粒扩增2)收集和裂解细菌3)分离、纯化质粒DNA,分离质粒DNA三步曲,分离 质粒,收集 裂解 细菌,质粒 扩增,二、实验原理,基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。,碱性条件下： 染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。 质粒DNA的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的
12、两条互补链不会完全分离。,pH值至中性： 染色体DNA不能复性形成网状结构，通过离心，与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 质粒DNA恢复原来的构型。,三、实验材料,宿主菌：大肠杆菌DH5a菌株 载体：PMD-18T质粒 插入片段基因：CHD5,CHD5,米尔副教授领导的研究小组发现的CHD5，其编码基因位于1号染色体的特异部分（1p36）。当CHD5失去功能的时候，细胞内平时起抑癌作用的系统会被关掉。CHD5如同肿瘤抑制网络的总开关，这提示CHD5与多种人类癌症有关。根据CHD5的调节功能，可以设计更好更有效的癌症治疗策略。此前，这个基因一直是个谜。这项研究对
13、未来的癌症治疗将产生重要影响，提高CHD5的表达量会带来额外的抑癌效果。临床实验中也发现，许多神经胶质瘤患者的CHD5基因缺失，说明CHD5与人类癌症有莫大关系，打开CHD5开关功能的药物可能会对很多种癌症的治疗有效。,补充知识：模板基因,溶液P1（细菌悬浮液）已加入RNaseA 溶液P2（细菌裂解液） 溶液P3（中和液） 去蛋白液PE 洗脱液WB已加入无水乙醇 灭菌水,（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5 （三）试剂： LB培养基（液体、固体） Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）,溶液 I,50
14、mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L TrisCl (pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 2 mg/mL 溶菌酶 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块,溶液 II,0.2 mol/ L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释) 1% SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 注意：时间勿太久，动作要温和，轻轻颠倒几次,溶液 III,5mol/L 乙酸钠 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 所配成的溶液中钠的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。 作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白
15、-SDS线性DNA沉淀，Na可中和DNA 注意：复性时间不宜过长,2、离心层析柱,硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质； 通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； 低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；,四、实验步骤,取1.5ml培养物加入Eppendorf管中 9000rpm30 s，弃上清加入250l 溶液P1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。加入250l 溶液P2，颠倒610次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮. 加入400l 溶液P3，立即温和混匀，室温放置3-5min。13000rpm离心10min，小
16、心取上清液（700-800l ）。 将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液。 加入500l去蛋白液，13000rpm离心1min，弃滤液， 向吸附柱中加入500l 漂洗液WB， 13000rpm离心1min ，弃滤液。 重复步骤8一次。 空柱13000rpm离心2min，然后室温放置3-5min，使残留乙醇挥发。 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加60l-100l洗脱缓冲液，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA， -20保存备用。,质粒定量检测,紫外分光光度计法,原理：1,物质在光的照射下会产生对光的
17、吸收效应 2,而且物质对光的吸收是具有选择性的3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱,一、质粒定量,紫外吸收检测质粒DNA的浓度,因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。,记录OD260值，通过计算确定DNA浓度，公式如下: 质粒DNA(g /ml)=50(OD260) 稀释倍数,根据在260nm以及在280nm的读数比值（ A260/280 =OD260/OD280）估计核酸的纯度,A260/280=1.8 DNA样品较纯,符合实验要求 A260/2801.9 RNA污染 A260/2801.6 有蛋白质或其它杂质
18、的污染,注意:eppendorf公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度和A260/280值.,A260/A280可以反应DNA的纯度：,二、实验仪器,核酸蛋白测定仪,比色杯,三、实验方法,1打开仪器电源开关，无需预热 。 2根据样品的不同，在仪器控制面版上选择对应的方法组，如测量质粒DNA浓度选 ， 测量RNA浓度选 等，以此类推。 3选择进入方法组后，选择你所需要的方法，然后按enter键 确认。 4按parameter/dilution键 设置样品稀释倍数，输入样品的体积和稀释样品所用稀释液的体积，按enter键 确认。（取质粒DNA样品2l +98l灭
19、菌水） 5后推打开仪器上放置石英比色皿的槽盖。 6按照设置的稀释方法，先向石英比色皿中加入对应体积的空白稀释液，然后把石英比色皿放入检测槽，按blank键 进行调零。 7再按照设置的稀释方法，向石英比色皿中加入对应体积的样品，并用微量加样器轻轻混匀。 8按sample键 ，仪器会根据样品的稀释倍数自动计算出样品的最终浓度。 注意事项： 1为确保液体始终处于检测区的中心位置，被检测样品的体积必须50ul。 2为避免石英比色皿受到污染，每次检测样品浓度前后都要用灭菌蒸馏水或去RNase水清洗石英比色皿 3实验结束后，前推盖上检测槽的槽盖，并关掉仪器电源。,数据处理,琼脂糖凝胶电泳DNA agaro
20、se gel electrophoresis,一、琼脂糖凝胶,天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose ，约占80）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。,在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度
21、与相对分子质量的对数值成反比关系。作用：凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：一般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环。,二、琼脂糖凝胶电泳原理,染色 溴化乙锭(EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性。 Gelview:荧光染料,在紫外光照射下呈现绿色荧光,琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围,胶浓度越大，越适宜分离的DNA越小,影响迁移速率因素,1、 DNA的分子大小2、 琼脂糖浓度3、 DNA分子的构象 4、 电源电压 5、 嵌入染料
22、的存在 6、 离子强度影响,三、实验材料,电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 6loading buffer Gelview ：荧光染料,在紫外光照射下呈现绿色荧光 TBE：TBE贮液2L：54g Tris-base、27.5g硼酸、20ml 0.5M的EDTA(pH8.0)加水至1L, 用钱稀释10倍 琼脂糖：1g 5、 DNA Marker5000,DNA Marker 是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。 应选择在目标片段大小附近
23、ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。,凝胶准备,胶床准备,铺胶,静置,胶床置于电泳槽中,加电泳缓冲液,拔梳子,上样,电泳,取出凝胶,拍照,三、实验步骤,样品准备：将6l PCR产物、提取的质粒DNA、分别与大约为样品体积1/6的loading buffer用加样器轻轻混匀；上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中；盖上电泳槽，接通电源，开始电泳； 电泳条件：电压120v；时间2530分钟；电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带,注意事项,凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定，所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60
24、，温度太高会使制板变形。 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向要竖直向上，不要弄坏点样孔 电泳前，确认样品孔位于电场负极； 点样时枪头下伸，一定不要弄破胶，并且点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多 Gelview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔 紫外线照射不要太久,采用1琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物、酶切产物以及提取的DNA,四、结果分析,DNA-marker,质粒DNA,PCR产物,酶切产物,点样顺序,五、预期实验结果,M: DL5000 DNA Marker 1, 4,7,10 为质粒 2, 5,8,11 为PCR目的条带; 3, 6,9,12为酶切片段,温馨提示,防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。 Gelview是强诱变剂，有致癌性，操作时要带手套，防止污染。所有含有Gelview的溶液在弃置前应当进行净化处理。,一、回顾实验流程,简述实验内容流程，PCR操作步骤 煮菌，PCR（PCR程序最后设4保温）约2小时收集PCR产物 学习PCR原理 质粒DNA提取（约1小时） 紫外检测定量知识（计算方法），步骤 紫外检测定量 琼脂糖电泳原理 电泳（样品：质粒DNA，PCR产物，酶切产物，Marker）约30分钟 观察电泳结果、记录、拍照、保存,思考题,碱法提质粒中溶液I、II、III的作用？ 2.简述PCR产物电泳出现非特异扩增条带的原因。,
