1、104 现代检验医学杂志第27卷第1期2012年1月 J Mod Lab Med，V0127，No1，Janua2012Roche电化学发光免疫法检测NTproBNP的检测限值和功能灵敏度研究索明环，张秀明，温冬梅，王伟佳，李 飞，欧阳能良，阚丽娟，严海忠(中山大学附属中山医院检验医学中心，广东中山 528403)摘要：目的探讨电化学发光免疫法检测N末端B型利钠肽原(NTproBNP)的检测限值和功能灵敏度。方法参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)Ep-17A文件制备生白样品及系列低浓度样品。空白样品采用配套的稀释液，系列低浓度样品采用倍比稀释的方法获得。样品制备后用Roche Coba
2、s E601电化学发光免疫系统检测NT-proBNP浓度，以确定该方法的空白限、检出限和功能灵敏度。结果NT-proBNP的空白限为253 pgml，检出限为775 pgml，10CV时的功能灵敏度为882 pgml。结论建立了Roche Cobas E601电化学发光免疫系统检测NT-proBNP的空白限、检出限和功能灵敏度，为临床诊断和治疗提供了更有价值的信息。关键词：N末端B型利钠肽原；电化学发光免疫法；空白限；检出限；功能灵敏度中图分类号：R446文献标志码：A文章编号：16717414(2012)0110404doi：103969 167卜74142011033Research on
3、 Limits of Detection and Sensitivity of RocheElectrochemiluminescence Immunoassay in the Detection of NTproBNPSUO Ming-huan，ZHANG Xiuming，WEN Dongmei，WANG Wei-jia，LI Fei，OUYANG Nengliang，KAN Lijuan，YAN Hai-zhong (Laboratory Medical Center，the Zhongshan Hospital of Sun Yatsen Universitiy，Guangdong Zh
4、ongshan 528403，China)Abstract：Objective To evaluate the limits of detection and functional sensitivity of electro-chemiluminescence immunoassayin detection of NTproBNP using Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)EP一17AMethods Blank and a seriallow consistency samples were detected by Roch
5、e Cobas E601 electrochemiluminescence immunoassay system to establish thelimit of blank，limit of detection and functional sensitivity of NTproBNPSuporting diluent was blank sample and a seriallow consistency samples were abtained by dilutionResults The limit of blank and limit of detection of NT-pro
6、BNP was253 pgml，775 pgml，respectivelyThe functional sensitivity was 882 pgm1Conclusion The limit of blank，limit ofdetection and functional sensitivity were established successfully in laboratories，which could provide more important infor-mation for the clinical diagnosis and therapyKeywords：Ntermina
7、l pro-brain natriuretic peptide；limit of blank；limit of detection；electrochemiluminescence Immunoassay；functional sensitivityN末端B型利钠肽原(Nterminal probrainnatriuretic peptide，NTproBNP)检测作为一种方便、有效的手段被越来越多的应用于心源性肺源性急性呼吸困难的鉴别诊断1、心力衰竭CHF的危险分级及预后评估等方面2，并已被美国心脏学会(AHA)3等机构列入相应的“心力衰竭”诊断指南中。目前，血清NTproBNP的定量检测国
8、内外主要采用Roche Elesys电化学发光免疫分析系统，包括Elesys 1010，Elesys2010，E170和CobasE601等，其中Cobas E601是最新一代的电化学发光免疫分析系统。按照医学实验室认可标准IS015189和临床实验室管理办法的要求，实验室必须对其主要分析性能进行验证或评价，证实其能够达到临床检测所要求的质量后方可用于临床检测。本研究主要参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)的EP-17AE4文件，对Roche CobasE601电化学发光免疫分析系统检测NTproBNP的空白限(1imit of blank，LoB)、检出限(1imit ofdetect
9、ion，LoD)和10CV时的功能灵敏度(functional sensitivity，FS)进行评价，旨在为临床提供更可靠的诊断信息。1材料和方法11材料111检测系统的组成：Roche Cobas E601电化学发光分析仪及配套NTproBNP检测试剂盒(批号：157123)，Roche公司通用稀释液(批号：*基金项目：广东省医学科研基金课题(A2009763)，中山市科技局资助课题(20091A038)。作者简介：索明环(1982一)，女，医学硕士，检验技师，主要从事I临床生化检验T-作，Tel：13531802763，E-mail：smhuan0525126corn。通讯作者：张秀明，
10、主任技师，硕士生导师，主要从事方法学评价研究，Email：zxm0760163corn。万方数据现代检验医学杂志第27卷第1期2012年1月 J Mod Lab Med，V0127，No1，Janua2012 10515592203)，配套2水平校准品(批号：156070，采用厂家推荐校准频次)及2水平质控品(批号：155039，155040)。112样品制备：用Roche公司通用稀释液做空白样品以确定空白限。收集康体保健中心1824岁正常男性血清10 ml，备用。用稀释液对低浓度正常人血清做系列稀释，制备浓度为25，50，75，85，100 pgml系列样品，用来确定LoD和FS。12 方法
11、121实验前准备：每天对仪器进行维护保养、质量控制，并执行定期校准。122 LoB试验：用仪器专用稀释液做空白样品，每天检测2批，每批重复检测6次，连续5天，记录光量子值，共获得60个结果。由于Roche CobasE601检测系统厂商声明的灵敏度为50 pgml，浓度小于50 pgml时仅提供光量子值，本实验通过拟合公式将光量子值转化为浓度值。按国际标准化组织的要求，在规定I类错误水平a一5的条件下，确定LoB。若数据呈正态分布，则采用参数方法估计LoB。若数据呈非正态分布，则采用非参数检验，将空白样品的结果由小到大排序，第95百分位数值即为LoB。123 LoD试验：收集无溶血、无黄疸、无
12、脂浊的1824岁正常男性血清10 ml，3 500 rmin离心10 min，取600肛l在Roche Cobas E601系统上重复测定3次，结果分别为1062，1026，959 pgm1，取均值1016 pgml作为测量值。按照EP一17A文件对LoD实验样品的浓度范围应在LoB 14倍之间的要求，用专用稀释液对上述血清做系列稀释，制备预期浓度为25，50，75，85，10。0pgml的系列样品，分装，一20贮存备用。将这些样品每天上、下午各检测1批，每批重复检测2次，共进行5天，记录其光量子值和浓度值。按国际标准化组织的要求，在规定类错误水平B一5的条件下，确定LoD。若数据呈正态分布，
13、则采用参数方法估计LoD。若数据呈非正态分布，采用非参数方法估计LoD，是低浓度样品测定中位数和第5个百分位数的间距。124 FS试验：样本制备和实验方法同LoD。依据临床化学实验室心衰标志物指南对NTproBNP测定不精密度CV10的要求5，对系列低浓度样品进行检测，计算均值、标准差和变异系数，CV最接近10的实验样品所具有的分析物含量即为功能灵敏度。2 结果21 空白限(LOB)仪器直接给出的所有空白测定结果均小于5 pgml。根据测定的光量子值，经拟合转换成具体的数值。经正态分析，数据呈非正态分布，故采用非参数检验，将空白样品的结果由小到大排序，第95百分位数值即为LoB。根据公式得出第
14、95百分位数为第575。表1为空白样品第5160位的检测结果。第575位的结果为(248+257)2253 pgml，即LoB为253pgml。表1 空白样品第5160位数值22检出限(LoD) 系列低浓度样品测定结果见表2。经正态分析，数据呈非正态分布，故采用非参数检验。将所有结果由小到大排序，第110位和第2130位的结果见表3。中位数为第255位置结果即(650+683)2667 pgml，第5百分位数值为第3位置结果即145 pgml，按下式计算LoD：DsB一667145522 pgml，LoDLoB+DsB一253+522755 pgml。表2 系列低浓度样品检测结果(pgm1)N
15、T-pr01姗 样品l 样品2 样品3 样品4 样品5浓度均值标准差变异系数()02018824029644314321717726718521811050431453535184225035901945193755244141493589560571709860702833650703642635687O991439683799967950894873946918912880882O859621013959108012061062116611491062108210261081O75695万方数据106 现代检验医学杂志第27卷第1期2012年1月 J Mod Lab Med，V0127，N
16、o1，Janua2012表3低浓度样品第110位和第2130位结果秩号 数值(pgn11) 秩号 数值(pgm1)1 020 21 5712 143 22 5903 145 23 6354 177 24 6425 185 25 6506 188 26 6837 1-94 27 7028 217 28 7039 240 29 70910 267 30 79923功能灵敏度(FS) 分别计算5个低浓度空白样品测定结果的平均值、标准差和变异系数(CV)，结果见表2。按照NTproBNP检测不精密度CVIO的质量要求，由表2可以看出，在浓度为882 pgml下，日间CV为962，最接近10，故FS为8
17、82 pgml。3讨论2004年，美国CLSI发表了确定检出限和定量检测限的方案即EP一17A文件，该文件对如何确定或验证定量检验方法的空白限和检出限，如何正确使用和解释各种限值，以及如何基于实验室在低浓度处的性能目标确定定量检测限提出了建议。Roche Cobas E601是最新一代的电化学发光免疫分析系统(其上一代产品为Elecsys E170)，按照IS015189和临床实验室管理办法的要求，实验室必须对其主要分析性能进行验证或评价，证实其能够达到临床检测所要求的质量后方可用于临床检测。本研究基于EP-17A文件要求，进行了灵敏度实验。本实验中60个空白样品的检测结果均小于50 pgml
18、，验证了厂商声明的检测限小于5 pgrnl的结论。同时通过对空白样品和低浓度样品的检测得出NT-proBNP检测的空白限为253 pgml，检出限为775 pgml，功能灵敏度为882 pgml。然而，其他研究人员也做了相关的实验。Rawlins等60分析了Roche E170检测NTproBNP的分析灵敏度，重复测定了10次空白样品和3次浓度为140pgml的样品，以140 pgml的样品为标准，通过计算得到的空白限(分析灵敏度)为30 pgml，低于厂商声明的50 pgml。Prontera等L7采用平均斜率法研究得到，Elecsys 2010检测NT-proBNP的检测低限(相当于空白限
19、)为42pgml。Yeo等81在2003年评价了Elecsysl010，Elecsys2010和E170的功能灵敏度，通过单次幂回归得到3个检测系统的功能灵敏度约为300pgml。国内屠强Lno用稀释试验做罗氏Elecsys 2010灵敏度分析，用实测值和理论值进行比较得到灵敏度为5。4 pgml。本研究得到的RocheCobas E601空白限为252 pgml，功能灵敏度为882 pgml，与以上报道不完全一致，这可能与分析灵敏度的定义、所采用的试验和统计方法以及设定的质量标准不同有关。目前评价分析灵敏度的方法有多种，并且每种分析方法的结果也不完全一致，并且存在很多概念和概念上的交叉1 0
20、。，应用比较混乱，迫切需要一个统一的标准来规范分析灵敏度的评价方法。美国CLSI EP一17A文件对如何确定和验证空白限、检出限提出了具体的要求和实验方法，被不少学者认为是评价分析灵敏度较为可靠的方法，但在实验过程中，发现该文件明显存在一些局限性，比如测试数太多，对于临床实验室成本比较高，并且规定在确定LoD时低浓度样品应介于LoB的14倍之间，但没有规定具体的浓度间距以及每一个样品重复测定的次数，这就对实验结果造成明显影响，使各个实验室的评价不具可比性，故CLSI EP一17A文件需要进一步的完善和补充。参考文献：1Murray H，Cload B，Collier CP，et a1Poten
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25、ed，V0127，No1，Janua2012 109致的。我们对细菌分离的科室进行了比较分析，结果显示，所有的这些高度耐药的细菌，绝大部分来自重症监护病房，这与医院中在重症监护病房为防止感染大量使用抗生素有关。相反，从其它科室分离的耐药细菌数量较小，并且分离细菌的耐药率也较低。对15种抗生素的耐药性显示，鲍曼不动杆菌对各类抗生素的耐药程度存在差异。对亚胺培南和美罗培南的耐药率为96，其中的几株原本耐药的菌株，在重复试验时表现为敏感，其原因可能是实验方法的差异，或者是在培养过程中产生耐药性的耐药质粒发生了丢失。并且我们分析发现，在2008年2010年这三年间，耐碳青霉烯类抗生素的比例是增加的。在
26、ICU分离的大量耐碳青霉烯抗生素鲍曼不动杆菌的现实提示，在这些科室应注意这类抗生素的使用。对其他种类的抗生素则表现出耐药程度的较大差异。G内酰胺酶类抗生素中，头孢他啶的耐药率为912，远高于2001年熊薇等1报道的328，头孢吡肟的耐药率也高达96。氨基糖甙类抗生素中阿米卡星的耐药率为944，哌拉西林的耐药率为100。舒巴坦作为可以同时抑制B内酰胺酶和青霉素结合蛋白的酶抑制剂，在体内可以增强抗菌性，头孢哌酮舒巴克坦的耐药率为304，中介率为584，敏感率为112。此外，氨曲南的耐药率为728，中介率为216，耐药率明显增加。综合以上分析，除了多黏菌素B的耐药率为08外，其他抗生素的耐药率都非常
27、高。抗生素的耐药性有多种耐药机制，其中最为常见的机制是获得携带耐药基因的质粒在不同细菌间传递。抗生素的广泛使用甚至是滥用，是引起耐药质粒在不同细菌间进行传递的根本原因5吖。了解各种抗生素的耐药机制及其在细菌间传递的机制，将有助于新型抗生素的研发。但是，作为临床治疗来说，更为重要的是严格控制抗生素的使用，特别是高级抗生素的慎用，有助于延长抗生素的使用周期。参考文献：1Perez F，Hujer AM，Hujer KM，et a1Global challen-ge of multidrug-resistant Acinetobacter baumanniiJAntimicrob Agents Ch
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