1、生 物 技 术 通 讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGYVol20 No2 Mar, 2009doi: 103969jissn10090002200902026综 述细胞培养稳定同位素标记技术在蛋白质组学中的应用与进展沈国波 ，徐玉环 ，龚凤鸣 ，梁淑芳四川大学 华西医院生物治疗国家重点实验室 ，四川 成都 610041摘要 细胞培养稳定同位素标记技术 （SILAC）是在细胞培养过程中 ，利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术 ，对蛋白表达进行定量分析的一种新技术 。 它不仅可以对蛋白质进行定性分析 ，还可通过质谱图上一对轻 重稳定同位素峰的比例来反映对应蛋白在不同状态下的表达水
2、平 ，实现对蛋白质的精确定量 。 SILAC 结合质谱技术在定量蛋白质组学中发挥了巨大的作用 ，其应用范围从细胞系扩展到亚细胞器 、组织与动物整体水平 ，具体的应用策略也在不断完善发展 。 我们总结评述了 SILAC 技术在差异表达蛋白质组 、蛋白质翻译后修饰 、药物蛋白质组和蛋白质相互作用等方面的应用与进展 。关键词 细胞培养稳定同位素标记 ；定量蛋白质组学 ；质谱中图分类号 Q52 文献标识码 A 文章编号 10090002(2009)02023805Application and Development of the SILAC Technique in ProteomicsSHEN G
3、uoBo, XU YuHuan, GONG FengMing, LIANG ShuFangState Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, ChinaAbstract The SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture) technique in combination with mass spec-trometry(MS) can take quantitative measu
4、rement of the expressing protein in different states according to the ratio of lightto heavy isotopic peak derived from the labeling protein It has played an important role in the field of quantitative pro-teomics The application of SILAC has become more and more extensive, and its specific strategi
5、es keep renewing Thispaper has made a summary of the application and development of SILAC on differential expression proteome, protein posttranslational modification, pharmaceutical proteome and protein interactions, and so onKey words stable isotope labeling with amino acids in cell culture(SILAC);
6、 quantitative proteomics; mass spectrometry定量蛋白质组学 （quantitative proteomics）是对组织或细胞表达的蛋白质进行精确定量和鉴定的一门学科 ， 研究方法主要包括双向凝胶电泳结合串联质谱技术和稳定同位素标记技术 。 传统的定量蛋白质组技术是双向凝胶电泳 （2DE）与质谱 （MS）联用 ， 通过蛋白斑点染色深浅的比较来对蛋白质表达水平进行定性 、定量分析 。 由于双向凝胶电泳技术对相对分子质量极高或极低 、等电点极酸或极碱 、低丰度蛋白质及膜蛋白等的分离和检测能力有限 ，用于定量比较蛋白质组学研究有很大的局限 。 近年新发展的细胞
7、培养稳定同位素标记 （stable isotope labeling withamino acids in cell culture，SILAC1； 或 称 amino acidcodedtagging，AACT2）技术 ，是在细胞培养过程中利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术对蛋白表达进行定量分析的一种新技术 ，不仅可以对蛋白质进行定性分析 ，还可精确定量 ，具有样本需求量少 、操作简单 、直接 、高效等特点1。1 SILAC 技术的原理分别用含轻型稳定同位素 （天然稳定同位素 ）和重型稳定同位素标记的必需氨基酸的培养基 ， 对处于 2 种不同状态的细胞（如一种为正常细胞 ，另一种为病理状
8、态的细胞 ）分别进行培养 、标记 ，待细胞标记完全后 ，将经过轻 、重型稳定同位素标记的 2种细胞等数量混合 ，提取蛋白 ，或将分别提取的蛋白等比例混合后经 SDSPAGE 分离 ，酶解提取肽 ，进行质谱检测 ，通过质谱图上一对轻 重稳定同位素峰的比例可以反映对应蛋白在不同状态下的表达水平1。 常用的标记氨基酸包括亮氨酸1、精氨酸34、赖氨酸5、酪氨酸 、缬氨酸6及甲硫氨酸7等 。SILAC 技术最初是为研究哺乳动物细胞系而建立的 ，随着研究的深入 ，其应用范围扩大到酵母 、细菌 、镰状疟原虫和植物研究中89。 但更重要的是 ，SILACMS 不仅在定量比较细胞来源或组织样品表达的差异蛋白上有
9、广泛的应用 ， 而且在蛋白质翻译后修饰的鉴定 、揭示蛋白 蛋白相互作用及信号通路研究上显示了巨大的潜力和优势 。2 SILAC 技术在蛋白质组学中的应用与进展SILAC 技术的应用范围和具体策略在不断发展更新中 ，在差异表达蛋白质尤其是肿瘤分子标志物的鉴定 、 蛋白质翻译后修饰 、 药物蛋白质组和蛋白质相互作用与信号通路等方面都有许多应用与改进 。21 SILAC 技术用于差异表达蛋白质组 （分子标志物鉴定 ）的定收稿日期 20080814基金项目 国家自然科学基金 （20505006）作者简介 沈国波 （1985 ）,男 ，硕士研究生通信作者 梁淑芳 ，（Email）zizi2006yaho
10、ocn238量 分析在不同的时期 、 不同的分化阶段 、 不同的生理和病理状态下 ，细胞 、组织表达的蛋白质的组成和含量都是有差异的 。 差异蛋白质组学正是基于研究这种差异而发展起来的 ， 它旨在动态地反映细胞 、 组织或生命体在特定状态下所表达蛋白质的变化规律 ，鉴定差异蛋白 ，寻找差异位点 ，发现新的蛋白及其功能 。 目前 SILAC 技术在差异蛋白组方面主要用于研究不同状态细胞 、细胞与组织及不同状态组织之间的差异蛋白1015，是寻找疾病 肿瘤生物标志分子的主要策略之一 。Everley 等3用 Lys 标记的方法比较了 2 株具有不同转移潜能的前列腺癌细胞系 PC3M 和 PC3MLN
11、4 表达的微粒体差异蛋白 ，共鉴定了 1 000 个蛋白质 ，其中 444 个含标记赖氨酸 ，在高转移潜能的 PC3MLN4 细胞中有 60 种蛋白的表达量较 PC3M明显增高 ，22 种蛋白表达明显下降 ，同时还发现了多种与前列腺癌细胞转移表型相关的新蛋白 ， 为前列腺癌的早期诊断奠定了实验基础 ， 这也是首次应用 SILAC 技术对 2 种细胞系进行比较研究 。在检测蛋白表达水平的定量分析上 ， 与 2DE 方法相比 ，SILAC 结合 MS 技术可以鉴定出更多的低丰度蛋白标志物分子和靶蛋白 ，这在肿瘤标志物筛选上潜能较大 。 Gronborg 等11应用SILAC 技术分析了人胰腺癌细胞
12、 PANC1 与胰腺导管上皮细胞HPDE 之间分泌的差异蛋白 ， 共鉴定了 145 个差异明显的蛋白质 ，其中包括 68 个上调蛋白 、77 个下调蛋白 。在这些蛋白中发现了几个可能的新的肿瘤标志分子 ，包括 CD9、基底膜蛋白多糖 、SDF4、apoE 和纤维连接因子受体 。 类似地 ，Vertegaal 等12通过SILAC 技术分析比较了小泛素相关修饰物 SUMO1 和 SUMO2的靶蛋白 ，发现了 53 个 SUMO 的靶蛋白 ，其中 44 个为新发现 ，有 25 个蛋白优先与 SUMO1 结合 ，19 个优先与 SUMO2 结合 ，另外还有 9 个既可与 SUMO1 结合 ，也可与
13、SUMO2 结合 。这表明 SUMO1 和 SUMO2 既有一些特异的生物学功能 ， 也有一些共同的生物学功能 。经典的 SILAC 技术只能对培养的细胞系而不能对组织来源的蛋白样品进行定量分析 。为了克服这一缺点 ，Wu 等13发展了用于组织标记的技术 。 他们用含15N 同位素的食物饲喂实验用鼠 ，以标记鼠的肝组织作为内标 ， 比较经放线菌酮处理的肝组织与正常肝组织表达蛋白的差异 ， 共鉴定了 301 个与放线菌酮诱导相关的蛋白 ，其中 127 个表现为有明显差异 。 该方法可以用来研究药物诱导的组织蛋白的变化 ， 作为研究疾病动物模型的有力工具 。 但该方法耗时较长 ，且有些组织标记不完
14、全 ，如脑组织 。Krger 等又将组织标记技术应用到基因敲除小鼠上 ， 发现含稳定同位素标记的饲料对小鼠的生长状况无明显影响 ， 同时他们揭示了 Kindlin3 蛋白在红细胞中具有重要作用 ，是红细胞发挥正常功能的必要因子14。鉴于组织标记技术耗时长及有些组织标记不完全 ，Ishihama等15以经典 SILAC 技术为基础 ，发展了一种改进的同位素标记技术 培养物衍生的同位素标签 （culturederived isotope tags，CDIT），其原理是以稳定同位素标记的细胞作为 2 个组织样品之间的内参 ， 组织样品 1、2 的蛋白分别与等量的标记细胞的蛋白混合后 ，对 2 组蛋白
15、混合样品分别进行 LCMS 质谱鉴定 ，再分别从鉴定的蛋白对应的一对同位素峰的质谱图谱上计算该蛋白在组织样品 1、2 与标记细胞中蛋白表达的相对变化比例 （Ra-tio1组织样品 1 标记细胞 ，Ratio2组织样品 2 标记细胞 ），再通过比较 Ratio1 与 Ratio2 的相对变化比例 （RatioRatio1Ratio2）来确定 2 种不同组织之间的差异蛋白质 。 CDIT 适用于组织来源的蛋白质的定量比较分析 ，为打破 SILAC 技术只局限于细胞株 ，以及从各种肿瘤样本中筛选鉴定新的灵敏的分子标志物提供了新的策略 。 尽管 Mann 等16开发了定量蛋白质组数据分析软件MS Qu
16、ant，但大量的数据和图谱仍然需要人工确认与分析 ，数据分析工作量也增大了许多 。 而且 ， 实验操作中数据的归一化（normalization）处理也更复杂 。此外 ，双标记的策略也在发展之中 。 Colzani 等17根据同比重同位素标记产生的亚氨离子的质荷比不同 ，分别用含13C 标记羧基碳和15N 标记氨基氮的缬氨酸 、亮氨酸和异亮氨酸 ，结合质谱技术 ， 对 2 株人黑色素瘤细胞系 SBCL2 和 SKmel28 进行了定量研究 。 通过定量轻 、重亚氨离子的相对离子强度 ，鉴定了 13 个在SBCL2 中明显上调的蛋白质 ，以及另外 13 个在 SKmel28 中过量表达的蛋白质
17、。 这些不同表达水平的蛋白质可能与这 2 个细胞系的不同形态及黏附特性相关 。22 SILAC 技术有助于翻译后修饰蛋白质的鉴定与修饰位点的确定蛋白质翻译后的修饰是蛋白质组学研究中的一个热点问题 。 许多蛋白质在翻译后会发生不同的修饰 ，如磷酸化 、糖基化 、甲基化 、乙酰化等 。 其中 ，蛋白质磷酸化是最常见 ，也是最重要的一种蛋白翻译后修饰方式 。 蛋白质的磷酸化在真核生物的信号转导中具有很重要的作用 。 为了揭示信号通路及其调节机理 ，首先要清楚在各种条件下有哪些磷酸化蛋白 ， 以及磷酸化位点的确定 。 由于蛋白质的磷酸化是一个动态的过程 ，这就需要我们对信号通路中的磷酸化过程做定量分析
18、 。 然而 ，现在还不能对磷酸化过程进行直接的分析 ，主要有以下几个原因18：对磷酸化的化学定量法效率很低 ，当给予外界刺激后 ，细胞内仅有一小部分的蛋白会发生磷酸化 ；蛋白质的磷酸化位点多变 ，磷酸化的蛋白质可能存在多种异构体 ； 许多信号分子在细胞内的丰度很低 ，需要对磷酸化蛋白进行富集 ，再进一步分析 ；目前研究蛋白质磷酸化的方法都具有一定的局限性 ， 在一定动态范围内它们可以对磷酸化位点的大体位置进行定位 ， 但不能对其做非常精确的定位 ；磷酸化的蛋白可能发生去磷酸化 ，这就需要在制备和纯化蛋白样品时采取措施防止去磷酸化的发生 。目前已建立了许多磷酸化特异性技术 ， 用于分析不同生物状
19、态下蛋白磷酸化的位点和动态调节 。 其中 ，稳定同位素标记的定量蛋白质组学方法通过特征性的同位素肽段丰度的差异来判别磷酸化 去磷酸化的发生与位点确定 ，在蛋白磷酸化动态分析中优势明显 。SILAC 结合免疫沉淀等生化手段不仅可以鉴定信号通路中发生磷酸化的蛋白组分 ， 而且还能揭示新的信号调控分子 。 2003 年 ，Ibarrola 等19应用 SILAC 技术分析蛋白质的磷酸化位点 。 他们用含12C 和13C 同位素的 Lys 分别标记 293T 细胞 ，分析外源性 Frigg 基因表达的磷酸化蛋白 ， 联合应用免疫沉淀技术 ，精确地找出了已知的 Frigg 蛋白的磷酸化位点 。 另外 ，
20、他们还通过双标记氨基酸的方法 ，鉴定了一系列新的磷酸化位点 。 Bla-goev 等20用含12C（或13C）、14N（或15N）同位素的 3 种不同结构形式的精氨酸标记 HeLa 细胞 ，结合免疫沉淀的方法 ，鉴定了 HeLa细胞中 81 个表皮生长因子 （EGF）信号途径中的酪氨酸磷酸化蛋白 ，并发现了 31 个新的 EGF 作用底物 。 Bose 等21用类似的方法沈国波等 ：细胞培养稳定同位素标记技术在蛋白质组学中的应用与进展239生 物 技 术 通 讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGYVol20 No2 Mar, 2009对人类表皮生长因子受体 2（Her2）的信号通路
21、做了研究 ，共鉴定出 462 个蛋白 ，其中包括许多已知的 Her2 信号分子 ，还发现了几种以前未鉴定出的 Her2 信号蛋白 ，包括酪氨酸激酶 （PTK）、衔接蛋白 （Fyb）、钙结合蛋白 Pdcd6Alg2Axl 等 。 类似地 ，Zhang等22用 Lys、Arg 双 标 记 氨 基 酸 的 方 法 并 结 合 免 疫 沉 淀 ，在ephrinB1Fc 的诱导下对 EphB2 信号通路的酪氨酸磷酸化作用进行了研究 ，共鉴定了 127 个蛋白 ，其中有 40 个上调蛋白 、6 个下调蛋白 ，另外还有 81 个蛋白无明显变化 。 此外 ，Gruhler 等23将双标记氨基酸方法扩展到酵母磷
22、酸化蛋白的信号通路研究中 。他们分析了信息素 因子诱导酵母细胞后蛋白质的磷酸化作用 ，采用强阳离子交换 （SCX）对酶解后的肽段进行了分离纯化 ，并用固相金属离子亲和层析 （IMAC） 技术对磷酸化肽段进行富集 ，大大提高了质谱分析的效率 。 共鉴定了酵母中与信息素诱导相关的 503 个蛋白的 724 个磷酸化肽段及 729 个磷酸化位点 ，并初步阐明了酵母中信息素调节蛋白磷酸化的信号通路 。最近 ，Spellman 等24又用 Lys、Arg 双标记氨基酸方法对初级神经元细胞中 BDNF 依赖的酪氨酸磷酸化信号做了研究 ， 这也是首次应用 SILAC 技术对只分化而不分裂的细胞进行研究 。
23、他们鉴定了几种在细胞内调节受体酪氨酸激酶转运的关键蛋白 ，如 BDNF 的受体 TrkB 和 RTK，以及 Hrs、STAM。这说明 SILAC 技术可以作为研究神经分子和神经细胞动态蛋白组质学的工具 。除了在磷酸化位点鉴定和信号通路中的应用外 ，SILAC 结合亲和层析富集分离技术也被成功地用于蛋白糖基化和甲基化的分析 。 蛋白质 O 位 N乙酰葡萄糖胺糖基化修饰 （OGlcNAcyla-tion）也是一种广泛存在于多细胞真核生物核蛋白与胞浆蛋白的蛋白质翻译后修饰 ，它在信号转导 、转录调控 、细胞周期调节 、蛋白降解 、 神经变性及应激反应中具有重要作用 。 已发现 OGlc-NAcyla
24、tion 的异常调节作用与很多疾病直接相关 ，如糖尿病和阿尔茨海默病 。 Wang 等25用锂选择性抑制细胞内的糖原合酶激 3（GSK3）， 利用 OGlcNAc 特异性亲和层析富集分离 OGlcNAc亚蛋白单位 ，并结合 SILAC 技术 ，共鉴定出 45 个可能的 OGlc-NAcylation 蛋白 ， 通过定量比较显示有 10 个蛋白表现为 GSK3抑制依赖的高 OGlcNAcylation，19 个蛋白为 GSK3 抑制依赖的低 OGlcNAcylation；还检测了中间丝蛋白的 OGlcNAcylation 位点 Ser55，最后 ，他们还研究了转录辅助激活因子 HCF1，发现在G
25、SK3 抑制后 ，HCF1 的 OGlcNAcylation 也表现为明显下调 。蛋白质甲基化分析则采用重同位素甲基 SILAC （heavy methylSILAC）方法26，也就是甲硫氨酸的甲基用 1 个13C 和 3 个2H 进行标记的策略来分析甲基化位点 。23 SILAC 技术在药理研究中的应用目前基于 SILAC 的定量蛋白质组学技术已经用于药物耐药机理和药物治疗作用靶分子等有关研究 。 现在普遍认为细胞对阿霉素 （adriamycin，Adr）的耐药性是由于膜泵 Pgp 被激活 ，而维拉帕米 （verapami，Vp）作为 Pgp 泵的抑制剂 ，可以抑制 Pgp 泵的作用 。 G
26、ehrmann 等27用 Lys 和 Arg 双标记法分别对阿霉素耐受的乳腺癌细胞 （MCF7Adr）和阿霉素 、维拉帕米双重耐药的乳腺癌细胞 （MCF7AdrVp）进行标记 ，比较了 MCF7、MCF7Adr 和 MCF7AdrVp 等 3 种细胞表达蛋白的差异 ，发现这 3 种细胞中 Annexin V、COMT、GST3、PDX2 等几种蛋白的表达有明显差异 ，其中 GST3 是一种潜在的调节细胞色素 P450 转录的分子元件 ，而乳腺癌中高表达的 P450 可能和预后不良有关 。线粒体功能异常 ， 尤其是线粒体复合体 的阻断与帕金森病的发病关系密切 ， 而鱼藤酮是线粒体复合体 的一个特
27、异性抑制剂 。 Jin 等28通过 SILAC 技术分析了用鱼藤酮处理前后的多巴胺能细胞 （MES）线粒体蛋白质的变化 ，共鉴定了 950 个与线粒体相关的蛋白质 ， 其中有 110 个蛋白的丰度在处理前后有明显变化 ，这些发现可能有助于进一步了解帕金森病的发病机制 。和厚朴酚是从传统中药材厚朴中分离出的可以抑制多种肿瘤细胞和实体瘤生长的有效组分 。 Ling 等29运用 SILAC 技术分析了和厚朴酚处理前后 HeLa 细胞中蛋白质的变化情况 ，发现有8 个明显上调 、77 个明显下调 ，在蛋白质水平证实了和厚朴酚是通过作用于多基因 蛋白的多途径来发挥抗肿瘤作用的 。24 SILAC 技术用
28、于检测蛋白质相互作用及动态变化蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体 ， 其功能通常是通过蛋白质之间的相互作用表现出来的 ， 这种相互作用存在于有机体每个细胞的生命活动中 ，同时相互交错形成网络 ，成为细胞中一系列重要生命活动主要的调节机制 。 经典的研究蛋白 蛋白相互作用的方法是酵母双杂交 ，但酵母双杂交的假阳性高 ，需要进一步的其他实验手段的验证 ，实验步骤繁多 ，而且不能用于翻译后修饰的蛋白分析 。 用 SILAC 结合 MS 技术解析蛋白 蛋白相互作用 ，可以克服酵母双杂交方法的局限 ，能有效区别背景 （假阳性 ）与真实的相互作用蛋白 ，检测弱的或不稳定的蛋白相互作用 ， 并能大规
29、模地实时分析蛋白相互作用的动态变化30。生长因子受体结合蛋白 2（Grb2）参与细胞内各种受体激活后的下游调节 ， 其 SH2 结构域能够直接与激活的表皮生长因子受体 （EGFR）磷酸化的酪氨酸结合 ，参与 EGF 受体介导的信号转导 ， 也能通过与 Shc 磷酸化的酪氨酸结合间接参与由胰岛素受体介导的信号转导 。 Blagoev 等31利用该原理 ，结合 SILAC 技术 ，研究了与 EGFR 信号途径相关的蛋白质 ， 共鉴定了 228 个与EGFR 相关的蛋白 ， 其中有 28 个通过 Grb2SH2 亲和纯化方法得到了富集 。 运用这种方法有效避免了由于蛋白间非特异性的结合及分离背景带来
30、的干扰 ， 它将成为研究蛋白间特异相互作用的有力工具 。随后 ，Schulze 等31利用人工合成的含 SH2 结构域的短肽作为 “诱饵 ” 也研究了 EGFR 途径 ， 共鉴定了 148 个与EGFR 途径相关的蛋白 。类似地 ，Foster 等33用 SILAC 技术研究了与葡萄糖转运蛋白 4（GLUT4）有相互作用的胰岛素依赖蛋白 ，总共定量了 603 个蛋白 ，并鉴定了其中 36 个有明显上下调的与GLUT4 有相互作用的胰岛素依赖蛋白 。鉴定蛋白质间的动态作用在蛋白组学的研究中有着非常重要的意义 ， 但一直没有十分有效的实验手段来区分蛋白间的稳定与动态相互作用 。 Wang 等34发
31、展了一种新的方法 ，称作 MAPSILAC 技术 （即纯化后再混合的 SILAC 技术 ）。 他们研究了与人26S 蛋白酶体有动态作用的蛋白 （PIP），通过该方法共鉴定了 67个可能的 PIP 蛋白 ， 其中 14 个因为相对丰度很低而在经典的SILAC 技术被当作背景蛋白 ， 而其中的 57 个蛋白都是首次被报道的 PIP 蛋白 。 此外 ，在这 67 个蛋白中有 37 个被鉴定为蛋白酶体的稳定作用蛋白 ， 有 16 个被认为是蛋白酶体的动态作用蛋白 。 该技术为鉴定那些有重要意义而在以往研究中没有被鉴定出来的动态作用蛋白提供了有力的工具 。 同时他们也比较了MAPSILAC 技术与 Tc
32、PAMSILAC 技术 （即时段控制的混合后再纯化的 SILAC 技术 ）， 结果显示 MAPSILAC 更适于鉴定蛋白240复 合体的稳定和动态作用 。与 TcPAMSILAC 相比 ，MAPSILAC技术有许多优点 ，由于样品的纯化是同时进行的 ，它不会发生标记蛋白间的相互交换 ， 这也保证了蛋白间作用的特异性和较高的相对丰度比 ；另外可以筛选合适的混合孵育时间 ，保证蛋白间更好的相互作用 ，以达到良好的纯化效果 。采用经典的 SILAC 技术时 ， 容易将蛋白间的一些动态作用认为是非特异性的作用 。 Mousson 等35联合应用 MAPSILAC 和PAMSILAC 技术研究了人类 T
33、ATA 结合蛋白 （TBP）转录因子复合体的动态相互作用 。 TBP 作为真核生物中的一种重要的转录元件 ，在许多复合体中都具有重要作用 。 该实验检测到了已知的所有 TBP 辅助因子 （TAF）。 值得一提的是 ，他们在研究细胞周期的同步化中 ，发现一个 TAF（BTAF1）在亲和纯化中的动态交换过程中可以瞬间与其他蛋白结合 ，从而调节细胞的有丝分裂过程 。实验证明 ， 联合运用这 2 种技术也可以鉴定其他蛋白复合体中的转录元件 。 这 2 种技术联合应用 ，能有效地 、特异地检测蛋白质之间的相互作用 ，排除各类非特异性结合 ，减少了假阳性 。 同时还可以检测那些只在瞬间结合发生作用的蛋白质
34、复合体 ，从而发现一些未知的蛋白质相互作用 。25 SILACMS 在其他领域的应用基于 SILAC 的定量蛋白组学技术还在亚细胞器蛋白质组 、植物蛋白组学等领域有成功的应用 。 Andersen 等36运用 SILAC技术研究了细胞中核仁蛋白质的动态变化 ， 并用荧光显微技术验证了 SILAC 技术在核仁蛋白质组学研究中的可行性 。 该实验建立了一种定量核仁中高通量内源性蛋白的方法 ， 但它同时也可以成为研究细胞内其他细胞器 、 亚细胞结构和组成相关蛋白质动态变化的方法 ， 因为其他细胞器的蛋白在不同的生长条件和代谢水平时 ，其蛋白组成也是不断变化的 。 他们认为核仁内蛋白质的组成不是惟一的
35、 ， 具体的蛋白组成与不同的细胞状态和条件相适应 ，是动态变化的 。要全面描述蛋白质组的动态变化 ， 就需要知道蛋白个体在细胞内的转换比率 ， 这点在利用 SILAC 方法培养的单细胞中可以做到 ，但要在动物体内实现还有一定的难度 。 Doherty 等6用含稳定同位素的 Val 的饲料饲喂雏鸡 ，通过检测不同时间段的蛋白的相对丰度 ，可以准确描述蛋白的动态变化过程 。Gruhler 等9还将 SILAC 技术进一步应用到了植物蛋白组学的研究中 ，他们通过标记拟南芥细胞 ，分析由于水杨酸的刺激而引起的谷胱甘肽转移酶的表达变化 ，亲和纯化 1433 磷酸化结合位点蛋白 。 该实验证明应用 SIL
36、AC 技术可以对植物中诸如细胞应激反应 、细胞信号激活等复杂的生物过程进行研究 。3 结语SILAC 结合 MS 技术作为定量蛋白质组学的一个重要方法 ，还处于不断发展和创新中 ， 从最初的仅仅局限于对培养细胞蛋白表达的分析 ， 扩展到细胞和组织及组织之间的蛋白质表达与蛋白相互作用等多领域的应用 。 细胞水平和组织水平的蛋白表达往往存在差异 ，要研究生命体的状态 ，特别是病理状态 ，则需要上升到对组织的研究 ， 而 SILAC 技术恰好为我们提供了这样一个平台 ，它的不断发展也为我们提供了有力的支持 。 近年来 ，对疾病蛋白组学的研究 ，特别是对肿瘤的研究 ，有很大一部分都依赖于 SILAC
37、技术 ，通过这方面的研究 ，已经找到了许多侯选的肿瘤标志分子 ， 这也为肿瘤的临床治疗提供了科学依据 。 虽然SILAC 技术还存在一些局限性 ， 还不可能解决研究中的所有问题 ，但随着技术的不断发展完善 ，其应用范围会越来越广 。参考文献1 Ong S E, Blagoev B, Kratchmarova I, et al Stable isotope labelingby amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurateapproach to expression proteomicsJ Mol Cell Proteo
38、mics, 2002,1:3763862 Chen X, Smith L M, Bradbury E M Sitespecific mass taggingwith stable isotopes in proteins for accurate and efficient protein i-dentificationJ Anal Chem, 2000,72:113411433 Ibarrola N, Kalume D E, Gronborg M, et al A proteomic approachfor quantitation of phosphorylation using stab
39、le isotope labeling incell cultureJ Anal Chem, 2003,75:604360494 Blagoev B, Kratchmarova I, Ong S E, et al A proteomics strategyto elucidate functional proteinprotein interactions applied to EGFsignalingJ Nat Biotechnol, 2003,21:3153185 Gu S, Pan S, Bradbury E M Precise peptide sequencing and pro-te
40、in quantification in the human proteome through in vivo lysinespecific mass taggingJ Am Soc Mass Spectrom, 2003,14:176 Doherty M K, Whitehead C, McCormack H, et al Proteome dynam-ics in complex organisms: using stable isotopes to monitor individ-ual protein turnover ratesJ Proteomics, 2005,5:5225337
41、 Ong S E, Mittler G, Mann M Identifying and quantifying in vivomethylation sites by heavy methyl SILACJ Nat Methods, 2004,1:1191268 de Godoy L M F, Olsen J V, de Souza G A, et al Status ofcomplete proteome analysis by mass spectrometry: SILAC labeledyeast as a model systemJ Genome Biol, 2006,7:R509
42、Gruhler A, Schulze W X, Matthiesen R, et al Stable isotope la-beling of arabidopsis thaliana cells and quantitative proteomics bymass spectrometryJ Mol Cell Proteomics, 2005,4:1697170910 Everley P A, Krijgsveld J, Zetter BR, et al Quantitative cancerproteomics: stable isotope labeling with amino aci
43、ds in cell culture(SILAC) as a tool for prostate cancer research J Mol Cell Pro-teomics, 2004,3:72973511 Gronborg M, Kristiansen T Z, Iwahori A, et al Biomarker discov-ery from pancreatic cancer secretome using a differential proteomicapproachJ Mol Cell Proteomics, 2006,5:15717112 Vertegaal A C O, A
44、ndersen J S, Ogg S C, et al Distinct andoverlapping sets of SUMO1 and SUMO2 target proteins revealedby quantitative proteomicsJ Mol Cell Proteomics, 2006,5:2298231013 Wu C C, MacCoss M J, Howell K E Metabolic labeling of mam-malian organisms with stable isotopes for quantitative proteomicanalysisJ A
45、nal Chem, 2004,76:4951495914 Krger M, Moser M, Ussar S, et al SILAC mouse for quantitativeproteomics uncovers kindlin3 as an essential factor for red bloodcell functionJ Cell, 2008,134:35336415 Ishihama Y, Sato T, Tabata T, et al Quantitative mouse brain pro-teomics using culturederived isotope tags
46、 as internal standards JNat Biotechnol, 2005,23:617621沈国波等 ：细胞培养稳定同位素标记技术在蛋白质组学中的应用与进展241生 物 技 术 通 讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGYVol20 No2 Mar, 2009（上接第 209 页 ）3 Evans C, Dalgleish A G, Kumar D Review article: immune sup-pression and colorectal cancerJ Aliment Pharmacol Ther, 2006,24(8):116311774 RouasFr
47、eiss N, Moreau P, Menier C, et al Expression of tolero-genic HLAG molecules in cancer prevents antitumor responses JSemin Cancer Biol, 2007,17(6):4134215 花瞻 HLAG 与肿瘤免疫逃逸 J 中国肿瘤生物治疗杂志 , 2003,10(4):2922946 Monu N, Frey A B Suppression of proximal T cell receptor sig-naling and lytic function in CD8tum
48、orinfiltrating T cells JCancer Res, 2007,67(23):11447114547 Zhou P, Litalien L, Hodges D, et alP ivotal roles of CD4effectorT cells in mediating agonistic antiGITR mAbinduced immuneactivation and tumor immunity in CT26 tumors J J Immunol,2007,179(11):736573758 Schink M, Troger W, Dabidian A, et al Mistletoe extract reducesthe surgical suppression of natural killer cell activity in cancer pa-tients a randomized phase III trial J Forsch Komplementmed,2007,14(
