1、遗 传 HER EDI TAS ( Beijing) 26 (4) :529 531 ,2004 技术与方法收稿日期 :2003 04 07 ;修回日期 :2003 07 15基金项目 :国家重点基础研究发展规划项目 (973 项目 ,G2000046806) ,国家自然科学基金 (30270917)和浙江省自然科学基金 (ZD0004)重点项目资助 The work was supported by the State Key Basic Research and Development Plan ( G2000046806) , the National Natural Science F
2、oundation ofChina (30270917) and Zhejiang Natural Science Foundation (ZD0004) 作者简介 :陈昆松 (1962 ) ,男 ,教授 ,博士生导师 ,专业方向 :果实分子生理与生物技术。 E2mail : akun zju. edu. cn改良 CTAB 法用于多年生植物组织基因组 DNA 的大量提取陈昆松 1 ,李 方 1 ,徐昌杰 1 ,张上隆 1 ,傅承新 2(11 浙江大学果实生理与生物技术实验室 / 农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室 ,华家池校区 ,杭州 310029 ;21 浙江大学生命科学学院
3、,华家池校区 ,杭州 310029)摘 要 :根据多年生植物组织富含多酚、多糖的具体特性 ,对现有的 DNA 提取方法进行了改进。通过增加提取缓冲液中 2巯基乙醇用量 ,简化氯仿 / 异戊醇抽提液步骤 ,改用经 - 20 预冷异丙醇沉淀 DNA 等 ,对 CTAB 法加以改进。改进后方法具有以下优点 : (1)获得的 DNA 质量良好 ,提取过程无明显的 DNA 降解 ,基本上排除了多酚物质的干扰 ;(2)用获得的 DNA 进行 Southern杂交 ,可得到理想的杂交信号 ,可满足相关的分子研究要求 ; (3)操作简便。关键词 :猕猴桃 ;DNA ;提取 ;Southern杂交中图分类号 :
4、S66311 文献标识码 :A 文章编号 :0253 - 9772(2004) 04 - 0529 - 03An Efficient Macro2met hod of Genomic DNAIs olation f rom Actinidia chinensis LeavesCHEN Kun2Song1 , L I Fang1 , XU Chang2Jie1 , ZHAN G Shang2Long1 , FU Cheng2Xin2(11L aboratory of Fruit Molecular Physiology and Biotechnology/ The State A gricult
5、ure Ministry L aboratory ofHorticultural Plant Growth , Development and Biotechnology , Huajiachi Campus , Hangzhou 310029 , China;21 College of Life Sciences , Zhejiang University , Huajiachi Campus , Hangzhou 310029 , China)Abs tract :It is a difficult problem to isolate high quality DNA from plan
6、ts containing a high contents of polyphenolics and polysac2charides , such as Actinidia plant. The protocol described in this paper is a modified CTAB (hexadecyltrimethylammonium bro2mide) method. High quality genomic DNA can be isolated from Actinidia plant using the improved method. The DNA is goo
7、d e2nough for Southern blot and other uses in DNA research. The protocol is also efficient for quick and macro2DNA extraction.Ke y w or ds : Actinidia ; genomic DNA ; isolation ; Southern blotDNA 保存方式包括 DNA 分子保存 (即 DNA 库保存 ) 、基因组文库保存、 cDNA 文库保存和特殊基因片段保存等。采用 DNA 保存 ,不仅具备其他资源保存方法的一般特点 ,还具有占用空间小、保存条件易于
8、控制、便于利用生物技术手段操作等优点。但DNA 保存方法要求有高纯度和完整性的 DNA 分子 ,而且提取和纯化 DNA 方便、省时、低耗等特点。虽然植物 DNA 提取方法不少 1 4 ,且各有其优缺点 ,但植物组织的组分复杂 ,不同的植物材料的组分各异 ,特别是多年生植物材料富含酚类物质和多糖 ,一些模式植物的 DNA 提取方法用于提取多年生植物材料时 ,难于去除多酚杂质和多糖 ,常出现获得的 DNA 产量低 ,质量差 ,产品 DNA 易降解等问题 ,有时甚至不能用作相关的 DNA 研究。本研究以多年生藤本植物猕猴桃为材料 ,针对其具体特点 ,在现有植物材料 DNA提取方法的基础上 ,进行适当
9、的改进 ,以获得可用于DNA 保存需要和相关分子研究的 DNA 分子。1 材料和方法111 植物材料试验所用植物材料为猕猴桃 ( A ctinidia chinen2sis Planch)幼叶。112 试验方法11211 基因组 DNA 的提取参照 Doyle 和 Doyle5 基因组 DNA 提取方法。取 110g 猕猴桃幼叶 ,加入适量 PVP ,于液氮中研磨后 ,转入经 55 预热的 20mL 2 CTAB 提取缓冲液 2 % CTAB , 100mmol/ L Tris2HCl ( p H 810 ) ,20mmol/ L ED TA ,114mol/ L NaCl 中 ,加 4 %
10、2巯基乙醇 ,在 55 水浴中轻轻混匀 ,使样品溶液温度达到 50 以上 ,取出于室温放置 10 15min ;加20mL 氯仿 :异戊醇 (24 : 1) ,抽提细胞残渣和叶绿体 ,盖紧盖子 ,翻转混匀约 100 次 ,直到氯仿相溶液变色 ;10000 g 离心 20min ;将上清液转到一支新离心管中 ,加入等体积经 - 20 预冷的异丙醇 ,盖紧盖子 ,翻转混匀 ,以沉淀基因组 DNA ,并用一玻璃棒将DNA 沉淀捞出 ;DNA 沉淀经 510mL 70 %乙醇清洗两次 , 510mL 100 %乙醇洗一次 , 37 干燥 30 60min ;加 110mL TE 缓冲液和 510 L
11、10mg/ mlRNA 酶 ,65 溶解。取 110 210 L 样品于 110 %琼脂糖胶上电泳 ,检查样品 DNA 的质量。11212 Southern 杂交1121211 基因组 DNA 的消化与纯化 600 L 总反应体系中 ,含有 20 g 基因组 DNA ,10 L 限制酶 ,60 L 10 限制酶缓冲液。在加入限制酶前 ,混合反应液于 4 下放置至少 1h ,先加 510 L 限制酶 ,混匀 ,置于 4 2 3min 后 ,转入 37 放置 30min ,加入另一半 (510 L) 限制酶 ,混匀 ,37 过夜。本试验所用的限制酶包括 : Kpn ( K) , Xba ( X)
12、,B am H (B) , Hind ( H) , EcoR ( E) , Pst ( P) 。将 600 L 反应液分成两部分 ,分别经 WizardTM微量 DNA 纯化系统纯化 ,并分别用 100 L 纯净水洗脱两次 ,以去除样品中的多糖和蛋白质 ,合并400 L 总洗脱液 ,加 1/ 10 倍体积 3mol/ L 醋酸钠(40 L) ,2 体积的 100 %乙醇 (880 L ) , - 20 下放置 1h ;12000 g (4 ) 离心 10min ;沉淀用 110mL70 %乙醇洗盐两次 ,12000 g (4 ) 离心 2min ;室温干燥 30 60min。用 20 L 纯净
13、水溶解沉淀。在017 %琼脂糖胶上电泳。1121212 同位素标记探针的制备 采用随机 DNA引物标记试剂盒 ( Random Primed DNA LabellingKit , Boehringer Mannheim 产品 ) 制备同位素标记p KLC1 探针。1121213 Southern 杂交 用 HybaidTM小型旋转杂交炉进行杂交反应 ,杂交液为葡聚糖硫酸酯 (Dex2tran sulphate , 含有 10 % Dextran sulphate , 110 %SDS ,110mol/ L NaCl) 。尼龙膜经葡聚糖硫酸酯杂交液 65 预杂交 2 5h 后 ,加入经 32 P
14、 标记的p KLC1 探针杂交过夜 (15 18h) 。洗膜条件为 :2 SSC (150mmol/ L NaCl ,15mmol/ L 柠檬酸钠 ) 42 5min ,两次 ;2 SSC 和 1 % SDS 65 30min ,两次 ;011 SSC 42 30min ,两次 ;最后用 011 SSC 65 洗膜 30min。洗后的膜在 - 80 下 ,用 X 光片 ( Ko2dak BioMax MS system)曝光数天 ,并用 Agfa (Curix60) X光片自动洗片机洗片。2 结果与分析211 基因组 DNA 的提取多年生植物组织富含多酚和其他杂质 ,一般的植物组织 DNA 提
15、取法难以满足高质量 DNA 的提取。我们采用经改进的 CTAB 法提取猕猴桃幼叶基因组 DNA ,如图 1 和 2 所示 ,得到了满意的结果 ,得到的基因组 DNA 产量高 ,纯度好 ,无降解 ,基本排除了组织中多酚物质、蛋白质和其他杂质的干扰 ,OD260/ OD280 1175 ,DNA 产量 1000 g/ g1FW。图 1 经改进的 CTAB 法提取猕猴桃基因组 DNA1 :110 L 基因组 DNA ;2 :210 L 基因组 DNA。Fi g. 1 Ext ra ct e d ge nomic DNA us ing imp r ove dCTAB met hod f r om A.
16、 c hine ns is le a ve s1 :110 L genomic DNA ;2 :210 L genomic DNA.035 遗 传 HER EDI TA S ( Beijing) 2004 26 卷 图 2 220 320nm 紫外波长范围内 DNA 样品扫描图Fi g. 2 S c a nning s p e ct r o gra m of DNAe xt ra ct e d f r om Actini dia pla nt212 基因组 DNA 的酶切与 S o ut he r n 分析以 p KLC1 为探针 , 对中华猕猴桃基因组 DNA的分析结果如图 3。每一消化反应
17、含有 20 g 基因组 DNA , 分别加入限制酶 Kpn ( K) , Xba (X) , B am H (B) , Hind ( H) , EcoR ( E)和 Pst ( P) , 经消化后的基因组 DNA 片段在017 %的琼脂糖胶上电泳分离 (图 3 左 ) , 并转移到Hybond N +尼龙膜上 , 然后用 p KLC1 探针进行杂交反应。结果表明 , 杂交信号条带的数目为 2 5条 (图 3 右 ) 。结果显示 , 用该方法提取的 DNA用于 Southern 杂交 , 获得良好的杂交信号 , 可满足多年生植物核酸研究要求。图 3 以 p KL C1 为探针的中华猕猴桃基因组
18、DNA S out he rn 分析(左 )基因组 DNA 限制酶消化图 ; (右 ) Southern 杂交图。Fig. 3 S out he rn a nal ys is of A. c hine ns is ge nomicDNA us ing p KL C1 a s a p r obeLeft : digested genomic DNA by restriction enzymes ;Right : Southern blot.3 讨 论应用植物 DNA 提取的一般程序 1 ,6 ,分离多年生植物的基因组 DNA ,难于满足相关的核酸研究需要 ,而多年生植物材料的 DNA 提取的研究
19、较少。Kim 等 7 以苹果、梨、葡萄、柿和 4 种针叶松等为材料 ,采用改良 SDS 法提取其基因组 DNA ,获得了较理想的结果。相对而言 ,我们所用的改进 CTAB法 ,不仅可以得到与 Kim 等 7 相似的结果 ,而且方法更为简捷 ,有效。本实验室已经采用本改进方法 ,先后对柑桔、金柑、梨、八角莲、明党参等多年生植物的基因组 DNA进行提取 ,均得到预想结果 ,方法具有普遍使用价值。本方法体系的建立 ,为进一步提高多年生植物DNA 提取纯度 ,采用生物高新技术手段建立濒危珍稀植物 ,尤其是多年生植物资源的 DNA 库 ,基因文库 ,保护和利用植物资源 ,以及开展相关的分子生物学研究提供
20、了一个新途径。参 考 文 献 (Ref e re nc e s ) :1 WAN G Guang2Lin , FAN G Hong2J un ( Editors in chief) . Princi2ple and techniques of plant gene engineering. Beijing : SciencePress ,1998 ,579 605.王关林 ,方宏筠 (主编 ) . 1998. 植物基因工程原理与技术 . 北京 :科学出版社 ,579 605.2 Aljanabi S M , Martinez I. Universal and rapid salt2extrac
21、tion ofhigh quality genomic DNA for PCR2based techniques. U ncleicAci ds Res , 1997 , 25 :4692 4693.3 Kaufman B , Richards S , Dierig D A. DNA isolation method forhigh polysaccharide Lesquerella species. Indust rial Crops andProducts , 1999 , 9 :111 114.4 Lefort F , Douglas G C. An efficient micro2m
22、ethod of DNAisolation from mature leaves of four hardwood tree speciesAcer , Fraxi nus , Prunus and Quercus. A nn For Sci , 1999 , 56 :259 263. 5 Doyle J J , Doyle J L . A rapid DNA isolation procedure for smallquantities of leaf tissue. Phytochem B ull , 1987 , 19 :11 15. 6 L I De2Bao , XU Ping( Ed
23、itors in chief) . Principle and methods ofrecombined DNA. Hangzhou : Zhejiang Scientech Press , 1994 ,131 132.李德葆 ,徐 平 (主编 ) . 1994. 重组 DNA 的原理和方法 . 杭州 :浙江科学技术出板社 ,131 132. 7 Kim C S , Lee C H , Shin J S , Chung Y S , Hyung N I. A simpleand rapid method for isolation of high quality genomic DNA fromfruit trees and conifers using PVP. U ncleic Aci ds Res , 1997 , 25 :1085 1087.135 4 期 陈昆松等 :改良 CTAB 法用于多年生植物组织基因组 DNA 的大量提取
