1、南方医科大学 朱浩,第三章 多序列比对,Multiple Sequence Alignment,ClustalX2.0的使用,ClustalX2.0是ClustalW2.0的带窗口版，可运行于Windows和Linux操作系统。下面的截图介绍如何使用ClustalX2.0 。,1.可到多个网站下载ClustalW/X，其中一个网站是ebi。点击黄色图标“Download Software”开始下载。,2.ClustalW存在多个版本，2.0之前统称ClustalW，2.0之后统称ClustalW2和ClustalX2。,3.选定版本后可选择下载ClustalW或ClustalX。,4.安装成功
2、后的界面，Load Sequence用于加载数据文件。注意数据文件必须在ClustalX目录里。,5.由菜单 Alignment- Alignment Parameters- Multiple Alignment Parameters 进入参数设置页面，这些参数包括Gap Opening、Gap Extension和各种替换计分矩阵。,6.ClustalX使用FASTA格式的数据文件。左图文件是所示例子的数据，每条数据有一个注释行，它以开头。,7.加载后比对前的数据。,8.由菜单Alignment-Alignment Parameters-Pairwise Parameters，选择Slow/
3、Accurate Pairwise Parameters，产生较高质量的结果。,9.由菜单 Alignment- Alignment Parameters- Pairwise Parameters，选择Slow/Accurate Pairwise Parameters，产生输出的ALN文件。,10.由菜单 Alignment- Alignment Parameters- Pairwise Parameters，选择Slow/Accurate Pairwise Parameters，产生输出的DND文件，它是系统的种系树。,11.由菜单Alignment-Alignment Parameters
4、- Pairwise Parameters，选择Fast/Approx Pairwise Parameters，产生的结果逊于Slow/Accurate Pairwise Parameters产生的结果。,12.选择Fast/Approx Pairwise Parameters后，同时选择Alignment-Iteration-Iterate each alignment step，结果仍比选择Slow/Accurate Pairwise Parameters的差。,13.将Gap Opening和Gap Extension均改为3后，可以看到减轻空格罚分后更多的空格被引入比对中。,在线版MA
5、P2的使用,在许多情况下多序列比对需要揭示被多个非保守区间隔的多个保守区，对此MAP2是个有效工具。下面的截图介绍如何使用在线版的MAP2 。,1.在线MAP2的网址以及两种输入数据提供方式。在本例中数据被贴入提供的窗口，数据与ClustalX2.0中相同，是23个动物中的miR-19。,2.主要的参数及其缺省值。DNA block penalty（Linux版本的参数major_diff）影响非保守区块的大小，mismatch score、gap open penalty和gap extension penalty只影响保守区中的全局比对。,3.MAP2以两种方式返回三个结果 在线窗口显示和
6、邮件寄回。本例使用在线窗口显示。,4.结果output包含所有成对比对的结果和多序列比对的中间结果。,5.缺省参数DNA block penalty=250只产生了一个保守区，即未能识别出hairpin结构中两个保守的stem。,6.结果.info给出了所有成对比对的得分信息。,7.参数可修改，在图示参数下重新进行了比对。,8.这次比对产生了二个保守区，即hairpin结构中两个保守的stem。,9.现在看一下相关的统计。在DNA block penalty=250的情况有： The total number of similar regions: 1 The total alignment
7、length of all similar regions: 72 The total length with consensus column identity bigger than 0.75 : 38 The portion of length with identity bigger than 0.75 : 0.53 （38/72=0.528）在DNA block penalty=50的情况有： The total number of similar regions: 2 The total alignment length of all similar regions: 43 The
8、 total length with consensus column identity bigger than 0.75 : 29 The portion of length with identity bigger than 0.75 : 0.67 （29/43=0.674）注意，尽管0.670.53不是衡量比对质量的唯一标准，但它确实是一个重要标准，它反映了保守区的质量。,10.与前面的ClustalX2.0例子相比，有几点需要注意： （1）先前在不同参数下运行了ClustalX多次，但产生的结果差别不大；而在不同参数下运行MAP2产生了显著不同的结果，这说明MAP2对影响非保守块大小的参数相当敏感。 （2） ClustalX给出了完整序列的比对结果，而MAP2只着重处理了保守块，基本忽略了非保守块。 （3）对于不太长的序列，ClustalX通常能给出满意的结果，但对于非常长的序列，可能需要使用MAP2。为了正确选择DNA block penalty，最好对序列的特性（特别是非保守区的大小）要有大致的了解；其次要使用不同参数进行多次比对，选取合理的结果。,
