1、荧光分析与 化学发光分析,冯振涛 1203180234,6-1 概 述,在前两章中我们讨论了物质对电磁辐射的吸收。吸收辐射能后，处于电子激发态的分子在返回基态时以发射辐射的方式释放这一部分能量，发射的辐射波长可以同分子所吸收的辐射波长相同，也可不相同，这一现象称为光致发光。最常见的两种光致发光现象是荧光和磷光。这两种光致发光过程的机理不同(见6-2)，可通过实验观察激发分子寿命的长短来加以区别。对于荧光，当激发光停止照射后，发光过程几乎立即停止(10-9 10-6)，而磷光则将持续一段时间(10-3 10s)。,一般所谓荧光现象是指物质吸收紫外光后所发射出的可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后
2、所发射出的波长较长的可见光荧光。但实际上荧光现象并不限于这些情况。有些物质吸收了比紫外光波长短得多的光后，发射出波长比所吸收的光波长稍长的光，这称为光荧光，并据此建立了光荧光分析法(有关此法的详细讨论见第十四章)。此外，有些物质吸收了红外光后发射出波长稍长的红外光，这称为红外光荧光。近年来，随着红外探测器灵敏度的不断提高，红外光荧光分析法已应用于许多有机物质的结构分析。,由于物质分子的结构不同，所吸收的紫外光波长和发射的荧光波长也有所不同，利用这个特征可以对物质进行定性鉴定。同一种分子结构相同的物质，用同一种波长的紫外光照射激发，可发射特征波长的荧光，其强度与物质的量有关。据此，可利用某些物质
3、被紫外光照射后所发射的能反映出该物质特性的荧光进行定性以及定量分析，这种分析称为荧光分析。,化学发光分析是利用化学发光现象进行分析测定的一类方法。与荧光分析一样，属于发光分析的范畴。化学发光与荧光分子的发光相似，他的大部分性质和荧光相同，不同点在于荧光的激发能来自外光源的激发(照射)，而化学发光的激发能则产生自化学反应，也即某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，使分子或原子被激发，这种受激分子或原子返回基态时，以光辐射的方式释放能量。其光辐射的能量及光谱范围由化学反应的物质所控制(处于可见光区)。每一个化学反应都有其特征的化学发射光谱，其发光强度则与物质的浓度有关，这是化学发
4、光分析的依据。,此外还有其他类型的发光: 生物发光、热致发光、放射发光(放射性分解引起激发)、声致发光(声波激发)、点发光(电激发)、摩擦发光(机械能激发)等。其中生物发光在分析化学中得到重要的应用，在生物发光中导致激发态的化学反应是在生物体内进行的。磷光现象也被用于分析目的，但应用范围有限。,6-2 荧光分析法,基本原理 荧光定性分析 荧光定量分析 荧光计与荧光分光光度计,1. 荧光的发生处于基态的分子吸收一定波长的辐射能后。电子发生跃迁。此时由原来的能级跃迁至第一电子激发态或第二电子激发态中各个不同振动能级和各个不同的转动能级，如图6-1中(a)和(b)所示。分子在吸收了光而被激发至第一或
5、更高的电子激发态的各个振动能级之后，通常急剧降落至第一电子激发态的最低振动能级，在这一过程中他们和同类分子或其他分子(例如溶剂分子)碰撞而消耗了相当于这些能级之间的能量，因而不发射光(无辐射跃迁，图6-1中c)。由第一电子激发态的最低振动能级继续往下降落至基态的各个不同能级时，则以光的形式发射，所发生的光即荧光(图6-1中d)。某些物质的分子在被激发至较高的能级并通过无辐射跃迁降落至第一电子激发态的最低振动能级之后，并不继续直接降落至基态，而是通过另一次无辐射跃迁至一个中间的亚稳的能级三重态(图6-1中e)。,一、基本原理,已知电子激发态的自旋多重性为2S+1，S是自旋量子数的代数和。大多数分
6、子含有偶数电子，在基态时这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中。然而，根据保利不相容原理，在一个轨道上的这两个电子的自旋是相反的，自旋量子数为+()和-()。由于自旋成对的结果，大多数分子的自旋量子数的代数和S=0，此时这个分子所处的电子能态称为单重态(singlet state)，即2S+1=1。如果分子中有一个未成对的电子，则S=，而2S+1=2，此种状态称为双重态(doublet state)。若分子中有两个未成对的电子，此时S=1,2S+1=3，这种状态称为三重态(triplet state)。,在基态分子的一个电子吸收光辐射而被激发的过程中，通常它的自选不变(S=0)，则激发态仍是
7、单重态，如图6-2所示。某些分子的激发单重态通过无辐射跃迁，在体系间跨越的过程中发生自选反转，造成两个电子自旋平行的状态，也即是激发三重态(6-2)。,这些分子在三重态稍事逗留后，在发射辐射而下降至单重态各振动能级，所发射的光即为磷光(图6-1中f)。因自三重态降落至单重态时所给出的能量比由单重第一电子激发态的最低振动能级直接降落至单重基态时所给出的能量小，所以磷光的波长比荧光波长长。如将温度降低，则由三重态降落至单重态的时间将大为延迟，在很低的温度下，这些分子有可能被“冻结”在三重态上。某些分子在跃迁至三重态后，通过热激活作用可 以再回到第一电子激发态的 各个振动能级，然后再由第 一电子激发
8、态的最低振动能 级降落至基态而发射出荧光， 这种荧光就被称为迟滞荧光 (图6-1中g和f)。,如果把蒽的乙醇溶液装入试管，并放在液氮中，并用紫外光照射，停止照射后，还能见到蒽溶液辐射出的橙色光，而光的强度随时间的延长而逐渐变弱，最终消失为止。这种即使停止用光激励，还能继续发光的现象，就是蒽的磷光。图6-3表明了蒽吸收了波长366nm的光，生成最低激发单重态S1， S1辐射荧光到基态，同时激发单重态S1体系间跨越到三重态T1，T1辐射磷光回到基态。,2. 荧光激发光谱和荧光发射光谱荧光发射光谱简称荧光光谱，它表示该荧光物质所发射的荧光中各种不同波长组分的相对强度，是以荧光强度对荧光波长所绘制的曲
9、线。如果把某物质的荧光光谱与他的吸收光谱进行比较，可发现这两种光谱之间存在着密切的“镜像对称”关系。荧光光谱好像是吸收光谱照在镜子中的像，但又比吸收光谱缺少了一些短波 长的吸收峰。图6-4表示蒽的乙醇 溶液的荧光光谱和吸收光谱。,3. 化合物的荧光和化学结构的关系产生荧光必须具备两个条件。首先，物质分子必须具有能吸收紫外或可见光的生色基团；其次该物质应具有一定的荧光效率。分子中能发射荧光的基团，称为荧光基团。荧光基团一定是生色基团，但生色基团未必一定是荧光基团。这是由于它的荧光效率不高，而将所吸收的能量消耗于与溶剂分子或其他溶质分子之间的相互碰撞，因此不能发射荧光。荧光效率(F)又称为荧光量子
10、产率，是荧光物质吸光后所发射的荧光量子数与所吸收的激发光的量子数的比值，即 F= 此外，一种物质吸收光的能力及量子产率又与物质所处的环境紧密相关，因为环境条件(如溶剂、pH、温度等)常常是物质量子产率高低，甚至能否产生荧光的重要因素。,发射的量子数,吸收的量子数,荧光通常发生于具有刚性平面结构的电子共轭体系的分子中，随着电子共轭度和分子平面度的增大，荧光效率也将增大，它们的荧光光谱也将移向长波方向。任何有利于提高电子共轭度的结构改变，都将提高荧光效率，使荧光波长向长波长的方向移动。绝大部分的荧光(磷光)物质都是环状化合物(芳香环或杂环)，芳香环越多，荧光效率越高，荧光光谱也移向长波长方向(表6
11、-1)。但环状结构并不是发生荧光的绝对条件，如吡啶( )、呋喃( )、噻吩( )和吡咯( )是非荧光或弱荧光物质。但取代上苯基后，由于共轭体系的增大，荧光效率将大为增加。例如苯并呋喃( )、吲哚硫茚的荧光和笨相近。,在芳香化合物的芳环上进行不同基团的取代，对该化合物的荧光强度和荧光光谱都将产生影响。通常有以下一些规律：(1) 给电子基团常使荧光增强，因为它们使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。作用特别明显的基团是-NH2和-OH。(2) 同电子体系相互作用小的取代基如 -SO3H、 -NH3 和烷基等，对荧光影响小。(3) 吸电子基团如-COOH、-NO2、-N=N-及卤素会减弱甚至破坏
12、荧光。(4) 重原子或杂原子引入到电子体系中常会减弱荧光，所以苯胺和苯酚的荧光较苯强20倍，而硝基苯、苯甲酸和碘代苯则是非荧光或弱荧光物质。表6-2表明取代基对苯的荧光的影响。,+,具有刚性平面结构的分子有利于荧光的产生。这可以比较荧光素和酚酞的结构来说明:,又如芴和联苯在类似的测量条件下的荧光效率分别为1.0和0.2。这是由于芴上的亚甲基增强了分子的刚性的缘故。,有些有机分子本身不会发荧光，但与金属形成络合物后，由于增强了他的刚性并大大减少了分子的内振动作用，因而产生荧光。,前文已述，由于物质分子结构不同，所吸收的紫外波长和发射的荧光波长具有特征性，因此根据荧光物质的激发光谱和发射光谱可鉴别
13、化合物。最直接的荧光定性分析方法是将待分析的荧光发射光谱与预期化合物的荧光发射光谱相比较。这种方法比较简便并常能取得较好的效果。图6-5(a)(b)是从一个城市河流底泥试样中以荧光法鉴定苯并()芘的实例。,二、荧光定性分析,图6-5 苯并()芘和苯并()芘的荧光激发光谱及发射光谱,对于一些复杂的样品来说，光谱鉴定有时会发生困难。可以采用标准加入的办法。即在试样中添加拟存在的组分，若此组分存在，则在添加该组分的纯物质加入后，该物质的特征峰将加强。同步扫描荧光法可使光谱简化和窄化，是原来互相重叠的光谱分辨开来，从而提高了荧光法的选择。同步扫描法通常在固定时进行，此时使激发单色器和发射单色器的波长差
14、(= Em- En)保持固定地同时进行扫描，所得谱图称为同步光谱，所测得的荧光信号为同步信号。,图6-7 菲、蒽、苝的光谱图,图6-8 萘、菲、蒽、苝、并四苯混合物的常规荧光光谱及混合物的同步光谱图,图6-9 工厂区大气样品萃取物中强致癌物苯并()芘及其共存物的荧光光谱和同步光谱,1. 荧光强度与浓度的关系荧光的发光是由于物质在吸光之后发射出波长较长的荧光，因此溶液的荧光强度与该溶液的吸光程度以及溶液中荧光物质的荧光效率有关。溶液被入射光(I0)激发后，可以在溶液的各个方向观察到荧光强度(F)。但由于激发光源能量的一部分被透过，因此，在透射光的方向观察荧光是不适宜的。一般是在与激发光源垂直的方
15、向观测。根据比耳定律，透过光的比例为式中： I0为入射光(激发光)强度； I为透过光强度；C为浓度，b为液层厚度；为摩尔吸光系数。相应地被吸收的部分是将上式重新排列，可得被吸收的光的量为I0-I= I0 (1-10 ) (6-3),三、 荧光定量分析,I,I0,- =10,-b C,-b C,1- - =1-10,I0,I,-b C,(6-2),(6-1),总的荧光强度(F) 同试样吸收的激发光的光量子数目和荧光量子效率(F)成正比F = F(I0-I)= I0 F(1-10 ) (6-4)将上式括弧中指数项展开可得F = I0 F (6-5)对于很稀的溶液，投射到试样溶液上被吸收的激发光不到
16、2 时，也就是b C =A0.05时，括弧内第二项以后可以忽略不计，则上式可简化为F = 2.3 F b C I0 (6-6)对于一定的荧光物质，当分析条件及仪器使用条件确定后，上式中F 、 、b 、I0 均为常数，当被测荧光物质的浓度C很小时(b C 0.05)，式(6-6)可写作F = kC (6-7)即荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系。但当b C 增大时，从式(6-5)可以看出浓度与荧光强度之间呈非线性关系，若b C 很大时，式(6-5)成为F = I0 F (6-8)此时荧光强度与浓度无关。因此在荧光分析中，荧光强度和浓度的线性关系仅限于很稀的试液。,-b C,2.3 b C- -
17、,(- 2.3 b C ),2!,(- 2.3 b C ),3!,2,3,2. 影响荧光强度的因素(1) 激发光照射的影响 对于容易分解的荧光物质的测定，应通过实验确定能准确读取荧光强度的方法。(2) 温度影响 通常荧光物质的溶液随着温度的降低而荧光强度增大。一般温度升高1，荧光强度约下降1。(3) 溶剂影响 一般来说，荧光强度随着溶剂极性的增大而增强。(4) 溶液pH的影响 当荧光物质为弱酸或弱碱时，溶液pH值的改变对荧光强度将有很大的影响。对于金属离子与有机试剂形成的络合物，溶液pH值的改变还会影响到络合物的组成，从而影响到它们的荧光性质。(5) 各种发散光的影响 主要是散射光和拉曼光。降
18、低方法:从仪器上考虑；从溶剂考虑。(6) 荧光熄灭 荧光物质和溶剂或其它溶质分子的互相碰撞或电子转移等作用引起的。卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等都是显著地荧光熄灭剂。(7)荧光自灭 荧光物质的浓度大于1gL时，常发生荧光的自灭现象。由上述可见，最适宜的测定条件如pH、溶剂、试剂的浓度、温度以及荧光强度最大时所需的时间等都需要试验来确定。,3. 定量分析方法(1) 标准曲线法 荧光分析一般多采用标准曲线(工作曲线)法，尤其在测定大批样品的例行测定时更是如此。(2) 直接比较法 取已知量的纯荧光物质配制一标准溶液，使其浓度在线性范围内，测定荧光强度(Fs)。然
19、后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度(Fx)。由标准溶液的浓度(Cs)和两个溶液的荧光强度，求试样中荧光物质的含量(Cx)。在空白溶液的荧光强度若未能使仪器读数调至0，则必须从Fs及Fx值中扣除空白溶液的荧光强度(F0)，然后进行计算。根据式(6-6)可得Fs - F0 = 2.3 F b I0 CsFx - F0 = 2.3 F b I0 Cx因为对于同一荧光物质， F及 相同，且b 一定，故(3) 荧光熄灭法 利用荧光熄灭现象可对某些物质进行定量测定。(4) 同步扫描荧光法 同步荧光信号的强度与欲测荧光物质的浓度(浓度很稀时)呈线性关系。但是，同步荧光法存在浓度效应。欲克服，只需将溶液适当
20、稀释即可。,F = 2.3 F b C I0 (6-6),Fs - F0 Cs,Fx - F0 Cx, = ,Cx = Cs (6-9),Fx - F0,Fs - F0,测定荧光强度的仪器有目测荧光计、光电荧光计和荧光分光光度计等。它们主要由光源、滤光片、或单色器、样品池及检测器等部件组成。常用的荧光计是由滤光片、硒光电池及微电流计装配成的光电荧光计，如图6-12。在测定微量荧光物质含量时，使用滤光片光电荧光计可得到满意的结果。但如前所述，各种不同的荧光物质具有不同的荧光光谱和荧光激发光谱，为了研究某种荧光物质的特性，或在建立荧光分析方法时选择合适的荧光波长，常需测绘荧光发射光谱和荧光激发光谱
21、。此时需要使用荧光分光光度计。其构造原理图如图6-13。图6-14为其仪器结构示意图。在该仪器所做的光谱上，最高峰波长就是物质在最大激发波长下所产生的最强荧光波长。荧光物质的最大激发波长和所产生的最强荧光波长是鉴定物质的根据，也是定量测定时最灵敏的条件。荧光强度的测量常采用同任意选定的标准进行比较。在日常分析中广泛采用的的标准是奎宁硫酸盐的硫酸溶液。另外，根据目的不同，可选择不同宽度的狭缝以得到较好结果。其选择的一般原则见表6-4.,四、荧光计与荧光分光光度计,分子发光法的灵敏度在很多情况下要比分子吸收法高很多，它是最灵敏的分析方法之一，所以更适合于低浓度物质的分析。已知在分光光度法中不但测量
22、透过试样的光强(I) ，还要测量入射光强度(I0)，同浓度相关的参数吸光度(A)是这两个信号(光强)比的对数(A=lg)。在测量低浓度溶液时，检测器必须能同时区别这两个较大信号的微小差别，因此在低吸光度时测量的精确度迅速降低。而在分子发光法中荧光强度(F)(磷光强度)直接同荧光(磷光)物质的浓度成正比。分子发光法的灵敏度通常要比相应分光光度法的灵敏度提高24个数量级。分子发光法的选择性一般也优于光吸收法，因为很多分子在紫外及可见光区都有吸收，但其中仅有一部分能再发射荧光或磷光，所以分子发光法的固有干扰少。因此，荧光法在环境监测上有重要的应用和进展。,6-3 荧光分析在环境监测中的应用,I0,I,一、空气中SO2的测定空气中SO2对波长190230nm的紫外光吸收最强， SO2 吸收紫外光后被激发至激发态。SO2+hv1 SO2 当激发态SO2 回到基态时，发射的荧光波长为330nm。SO2 SO2+hv2发射光强度和SO2浓度成正比。二、饮用水和熟食中硒的测定三、苯并()芘的测定,
