1、中国海洋大学硕士学位论文不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较姓名：盛文静申请学位级别：硕士专业：水产品加工及贮藏工程指导教师：薛长湖200706021不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较摘要本文选取当前市场销售的品质、价格不一的lO种海参，提取分离其多糖，从化学组成、波谱分析以及酸解寡糖组分分析三个角度分析比较了10种海参多糖。建立并优化了应用柱前衍生高效液相色谱测定海产动物多糖单糖组成的方法，同时测定糖醛酸、氨基糖和中性单糖。本方法快速、准确，应用性强，解决了当前海产动物中多糖、单糖组成测定繁琐、易受干扰的问题。海参多糖提取采用酶解、乙醇沉淀和季胺盐沉淀法；分子量测定采用高效凝胶过滤色谱
2、法；化学组成分析分别采用传统化学法和柱前衍生高效液相色谱法，并进行结果比较；硫酸基的取代位点采用红外波谱和核磁共振波谱测定；水解寡糖采用稀硫酸水解法进行，酸解寡糖化学分析采用薄层层析色谱和高效液相色谱进行。研究结果发现，10种海参多糖在化学组成上差异明显。多糖得率以中国产日本刺参为最高，达716，以日本刺参为最低，仅为131。所得10种海参多糖分子量集中在三大区域：大于70万，1625万以及O5一12万。Black teat多糖、北极海参多糖、冰岛刺参多糖、挪威红参多糖以及日本刺参多耱主要组分的分子量为1625万，其余5种海参多糖主要组分的分子量大于70万。10种海参多糖总糖、蛋白、硫酸基、糖
3、醛酸和氨基糖含量的波动范围分别为4033-621l，044一1948，1954-2995，9851338细492-1018。中性单糖测定表明10种海参多糖均含有岩藻糖和半乳糖，部分含有甘露糖和葡萄糖，且岩藻糖含量很高。10种海参多糖在阴离子交换树脂色谱柱上的洗脱曲线明显不同，除仿刺参多糖和日本刺参多糖外，其余8种海参多糖均在盐浓度为32 moL的洗脱条件下洗脱完全。柱前衍生高效液相色谱法采用2 molL TFA，110 oC，8h的水解条件，1一苯基一3一甲基一5一吡唑啉酮(P胛)衍生，ZORBAX Eclipse XDB-C18分离柱分离，紫外检测法对10种海参多糖进行单糖组成分析。其对中性
4、和碱性单糖组成的测定结果和传统化学法测定结果基本一致，但对糖醛酸的测定，传统化学法测定结果明显偏高，液相色谱法的测定结果较为准确。将液相色谱法推广至羊栖菜多糖、鱿鱼墨多糖、鲨鱼软骨多糖、鲨鱼鱼翅多糖以及褐藻胶等多种海产动植物多糖单糖组成的测定，结果令人满意。红外波谱表明，lO种海参多糖均含有羟基、羧基、乙酰胺基、硫酸基以及岩藻糖的甲基，且不同海参多糖硫酸基的取代位点不同。菲律宾刺参多糖、中国产日本刺参多糖、Sand Fish多糖、Black Teat多糖、j匕极海参多糖以及墨西哥刺参多糖的硫酸基取代位点是岩藻糖的C一4位或氨基半乳糖的c一4位；冰岛刺参多糖和美国肉参多糖的硫酸根取代位点可能在岩
5、藻糖的C一4位或氨基半乳糖的C一2位或c-4位；而挪威红参多糖和日本刺参多糖则可能在岩藻糖的p2位、C-3位、C一4位或者是氨基半乳糖的c_4位或c-6位存在硫酸根取代情况。核磁共振波谱印证了红外波谱的信息，同时给出双硫酸根取代和未经硫酸根取代岩藻糖的1H化学位移信号。除Sand Fish多糖外，其他海参多糖均存在c一2、c蚰4位双硫取代岩藻糖，而c-3、C-4位双硫取代岩藻糖只存在于菲律宾刺参多糖、SandFish多糖、Black teat多糖、北极海参多糖、冰岛刺参多糖以及日本刺参多糖中。除挪威红参多糖、美国肉参多糖和墨西哥刺参多糖之外，其余7种海参多糖均含有未经硫酸化的岩藻糖。酸解海参多
6、糖的最佳条件为005molL H2S04，8012，水浴18h。所得lO种海参寡糖经薄层层析色谱分离得到47个寡糖组分，北极海参多糖、美国肉参多糖、墨西哥刺参多糖、日本刺参多糖和挪威红参多糖得到的组分较为简单，分子量更为集中，有利于进一步的寡糖制备和结构分析。10种海参寡糖经高效液相色谱分析发现，酸解寡糖主要组分集中在分子量为9202000的部分，可能的聚合度为511。关键词：海参多糖；化学组成；波谱分析；酸解寡糖分析：l-苯基孓甲基喜毗唑啉酮Extraction and ghemicaI Component Analysis ofPo l ysaochar i des from D i仟er
7、ent Sea CucumbersAbstractTen species of sea cucumbers with di岱删price and quality were selected fromthe market for chemical，spectrum and hydrolyzation analysisPolysaccharides fromdi岱玎哪sea cucumbers were separated by papain,precipitated by ethan01analyzedwith six chemical indexes using traditional met
8、hod and HPLC，and eluted onQSepharose甩recording the elution curveSulfation position WaS determined by IRand NMR；hydrolyzation谢吐l H2S04 was analyzed by TLC and HPLCThe result shows that chemical component of polysaeeharides from ten species ofsea cucumbers arc obviously diversified,and the elution ClI
9、IWeS of thesepolysaccharides 011 QSephamse FF aIe distinctFor the yield often polysaeeharidespolysaceharlde from Apostichopus japonicus arrested in China ac缸eves the hi曲est，716and the lowest goes to polysaccharide from Apostichopusjaponicus arrestedin Japan，131The molecular weight often polysacehari
10、des falls into three groups：700，000，160，000-250，000，5,00012，000The molecular weight ofthe main fraClJOllof polysaccharides from Holothuria vagabunda，Holothuria mexicana,Cucumariafrondosa,Stichopus tremulus and Apostichopusjaponicus arrested in Japan are in thesecond group，and the rest five polysacch
11、arides are in the first groupContent of totalsugars，protein,sulfate，llroulc acid and aminosugar of polysaccharides from tenspecies of sea cucumbers are fluctuated within 4033621l。0440o-1948。1954-2995，985。o-1338and 492。o-1018，respectivelyNeutralmonosaccharide analysis shows that fueose and galactoexi
12、st in all the tenpolysaccharides wkile llaannosc and glucose existed partly，and the content of fucoscis very higlL Elution cI1rve of ten pelysaccharides on Q-Sepharose FF differsobviouslyAll the polysaccharides a埽eluted at the salinity of 32 molLexcept forthose from ApostichopusjaponicusA fast and s
13、ensitive method is developed for simultaneous determination of neutralsugars。amino sugars and uro碰c acids in polysaccharides extracted from Seacucumbers，whichisbesthydrolyzedunderthe conditionof2molLTFAat 110“C for8husing HPLC wi出1-phenyl-3-methyt一5-pyrazolone(PMP)derivatization andVariable Waveleng
14、th Detection(VWD)Compmed with the result determined intraditional method,the chromatography resuIt so,ms exact for aminosugars andneutral sugarsand lower for momc acid,but the latter me也od gives more preciresult and call be applied for monosaccharide component analysis in polysaceharidesfrom如fo,-me，
15、squid ink,shark bone，shark fin and seaweeds with satisfyingresultThe 1R analyMs of ten polysac圮harides shows that each polysaecharide containsgroups ofOH，-COOH，-NHAc，S04，-CH3，and is sulfated al different positionsSulfam groups of polysaccharides from Pearsonothria graeffei、Apos打chopusjaponicus arres
16、ted in China、Holothuria scabra、Holothuria vagaburMa、Holothuriamexicana and lsostichopusfuscus arc substituted at c-4 position offucose residues orC-4 position of galaetosamine residues；Sulfate groups of polysaccharides fromCucumara frondosa and Isos打chopus badionotus a1：e substituted at C4 position
17、offucose residues or C-24 position of galaetosamine residues；and those for Stchopustremulus and Apostichopus japonicus arrested in Japan ale at C-234 position offucose residues or C-46 position ofgalaetosamine residuesThe NMR analysis showsthal sulfate groups are disubstitued at C-24 positions in al
18、l the polysaeeharides exceptfor that of Holothuria scabra，and at C-3，4 positions in Pearsonothriagraeffei,Holothuria scabra,Holothuria vagabund,Holothuria mexicana，Cucumariafrondosa and Apostichopus japonicus arrested in JapanFucose without sulfationexisted in all the polysaccharides except for thos
19、e from Stichopus tremulu、Isostichopus badionotus and lsostichopus彝岱c憾The best hydrolytic condition forsea cucumber polysaccharides is with 005 tool。LH2S04 at 80“C for 18hFour toSeVan component are found in ten hydrolyzates after TLC separationComponentfrom Holothuria mexicana、Stichopus tremulus、lsos
20、fichopus badionotus、Isosfichopusfusc=and Apostichopusjaponicus arrested in Japan arc suitable for further analysis，HPLC analysis shows that the molecular weight often hydrolyzates is bctwe,cn 920 to2000，and the possible polymeric degree is 5 to 11Key words：se8 cucumber polysaccharide；chemical compon
21、ent；两挎ctr峨analysis；hydrolyzl ol igosaccharide analysis；1,-phenyl-31el：hyI卸yrazolone(P-P)独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注瓤致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文串作了明确的说明并表示谢意。一一竺幽竺竺!互!学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机
22、构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复铡手段保存、汇编学位论文。靴论文储鹳懈3跨签字日期：h0年月p日导师签字： 季0签字日期纠年g月t日学位论文作者毕业后去向：工作单位仁眺鹚)，家岑东召莎。司 电话：通讯地址： 邮编：不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较0前言01海参资源概述海参(acucumbers，holothurians)属于棘皮动物门海参纲，广义的海参包括海参纲所有的种类。水产上的海参系指那些可供食用的干海参。全世界有海参约1000多种，我国有约140多种。全世界约有40种海参可
23、供食用，我国约20种，其中有10种具有较高的商品价值lll。011世界海参资源概述全球有记录的海参种数约1000多种，分布于全球各大洋，主要在热带区和温带区，绝大多数进行底栖生活【2】。热带区海参资源呈多种性，多分布在太平洋热带区和印度洋，主要有印度尼西亚、菲律宾、马来西亚和南太平洋的新喀里多尼亚、斐济、巴布亚新几内亚等国家。热带区海参资源不仅种类多，而且资源量大，据统计，目前世界海参产量的86来自热带区。热带区海参资源主要有黑沙参(丘nobff妇)、白沙参(豇fuseogilva)、糙海参(H scabra)、多色糙海参值scabraversicolor)、棘辐肛参(4echinites)、
24、乌皱辐肛参组miliaris)、梅花参缸ananas)、绿刺参choloronotus)、花刺参variegatus)等。海温带区海参资源呈单种性，多分布于太平洋东西两岸的温带区，其中东岸以美国棘参僻californ洒)为主，西岸以棘参japanicus)为主。温带区主要有中国、日本、韩国、加拿大、美国等。其中，日本主要产区在北海道，美国主要产区在华盛顿州，加拿大全部产区在不列颠哥伦比亚省。温带区海参资源主要有刺参japonicus Selenka)、花刺参variegates Semper)、绿刺参岱chloronotusBrandt)、梅花参(Tananas Jaeger)、黑乳参micr
25、othele)等。012我国海参资源概述我国有海参约140多种，其中20多种海参可供食用，常见的食用海参归类于表Ol。表o-1我国食用海参的类群分布134lTable O-l Distribution of edible蝴encumbers in China科目 海参学名 中文名 产地 食用质量刺 Apos“chopus 体壁厚而软，是北部沿海的食用参 仿刺参山东、河北和辽宁沿海科 japonieus 海参中质量最好的一种不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较Pentaeta 裸五角 山东青岛、浙江嵊泗列体壁较硬，食用质量较差2不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较瓜参 岛、福建厦门、东山参p
26、aracaudina科 体壁很薄，品质较差，食用价值chinensis val： 海棒槌南北沿海浅海均常见很低rao,sonnetii013本研究所用10种海参资源概述本实验选取了当前市场销售的品质价格不一的10种海参，基本信息如表D屹所示。表o-2 10种海参资源基本信息Table O一2 Basic information of 10 Sea cucumbers3不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较02海参加工现状目前，国内海参产品主要有海参鲜品、传统海参干品、深加工的海参食品。海参加工是新兴行业，发展迅速，但是海参产品正面临着质量标准空白的窘境。传统海参于晶加工方法不仅粗糙两且复杂。通
27、常按以下环节处理：鲜参去内脏一清洗一煮参一腌渍一下缸一烤参拌灰一晒干一成品干参传统的海参干品加工方法缺点很多：一是干参食用之前需多次水洗、煮沸，水溶性及热敏性等营养活性物质损失太大：二是食用十分不便，水发时间长；三是容易以次充好、掺假使杂，判断干参好坏优劣无标准可循。同时，制品的体积缩小严重，复水较难，还容易出现表面结壳龟裂、脂肪氧化，导致产品表面变色等质量缺陷，影响了制品质量的均一性和耐藏性。为解决食用不便这一闯题出现的水发海参，在干参胀发过程中再次造成风味物质大量流失，产品已无鲜参风味。更为严重的是某些加工企业为了快发、多发，采用火碱等化学药剂发参，为了防腐甚至添加有害人体的物质，造成严重
28、的食品安全问题。深加工的海参食品分为以下几种：以新鲜海参为原料，热干后研磨成粉状4不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较制成胶囊剂型。以海参浆液为主体，配以蜂蜜、蜂皇浆等调味制成口服液型。海参的即食食品(海参的熟制品)，通常采用南方产量很高的梅花参、白参等为原料，熟制后烘干切成丝状或条状。将发制后的海参，真空包装或者罐装。海参酶水解制品，通过组织自溶、外源酶处理等化学方法，经喷雾干燥成粉剂或者经调味剂、防腐剂调配制成口服液型。这种工艺，可将海参中的蛋白质转变成可溶性的多肽或氨基酸，易于被人体吸收利用。以鲜海参为主要原料，经有益活菌发酵、喷雾干燥得到的发酵型海参营养素干粉。提取海参体内的活性物质
29、，制成含蛋白质、多糖等有效成份的胶囊。近年来，真空冷冻干燥技术被越来越多地应用于海参产品的研制工艺中。干燥后的海参含水量极低，不需任何添加剂和防腐剂，即可在密闭的真空环境下持续较长的保质期，且产品形体大而饱满，复水容易。冻干海参虽然生产成本高，但其附加值高，被公认为是目前最好的海参加工方法。总之，海参加工产品层出不穷，市场前景越来越广阔，但是也存在着一系列问题，如加工方法科技含量不高，海参行业标准亟待建立等。特别是海参产品质量标准空白这一窘境已引起社会广泛关注，这也为本课题提供了研究背景。03海参多糖研究概况海参多糖，主要存在于海参体壁及废弃内脏中。目前发现存在于海参体壁的多糖主要分两类：一类
30、为海参糖胺聚糖或粘多塘(Holothurian glycosaminoglycan，HGA6)，是由D-N乙酰氨基半乳糖、D葡萄糖醛酸和b岩藻糖组成的分支杂多糖，相对分子质量为4万一5万；另一类为海参岩藻多糖(Holothurian fucan，磁)，是由L岩藻糖所构成的直链多糖，相对分子质量为8万一lO万。两者的组成糖基虽不同，但糖链上都有部分羟基发生硫酸酯化，并且硫酸酯基类多糖含量均在32左右，两种海参多糖的特殊结构，均为海参所特有。由于HGAG的结构组成比HF复杂，下文的研究方法概述主要就HGAG展开。031海参多糖的提取分离HGAG是蛋白多糖的糖链部分。众多GAG以共价键(糖肽键)与蛋
31、白链相连，自然状态下，HGAG与蛋白链间通过非共价键(氢键等次级键)形成具有螺旋、折叠、盘绕、卷曲空间构象的大分子聚集体。HGAG的提取分离首要问题是在多糖不被显著降解的条件下去除结合的蛋白质【5l。提取分离HGAG不仅要破坏蛋白不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较多糖聚集体间的次级键(这只能分离蛋白多糖)，还要降解核心蛋白链，更主要的是要破坏多糖链与蛋白质的共价结合(糖肽链)。从而释放出多糖链，以便提取分离。目前常采用酌提取方法主要有碱提取法与蛋白质水解法。前者是基于蛋白多糖中的糖肽键对碱的不稳定性，该法简便易行。但由于碱处理后易发生walden转化或形成3，6-内醚衍生物而发生脱硫现象，
32、所以使这种方法的应用受到限制。蛋白质水解法是提取HGAGI比较理想的方法，它在不改变多糖链结构的前提下，先以碱处理，再以蛋白酶水解，对于HGAG的释放十分有效。同时为了使蛋白质充分水解，历用蛋白水解酶多采用两种以上酶制剂来加强水解效果。韩慧敏等61就曾采用匀浆技术，胃、胰蛋白酶降解蛋白质的方法，对HGAG的提取取得了良好的效果。巴西研究学者Rieardo PVieira等t71采用木瓜蛋白酶辅以半胱氨酸和EDTA酶解法提取L griseaGAG，效果良好。HGAG的分离方法主要有沉淀法，近年来又出现了离子交换色谱法及其它方法嘲。常用的沉淀剂有乙醇、季胺盐和醋酸钾，其中乙醇应用最为广泛。在HGA
33、G的钙盐、钠盐或钾盐溶液中加入不同含量的乙醇，多糖颗粒水化膜被破坏，溶液电离常数降低，HGAG便以盐的形式分级沉淀，从而得以分离。如陈菊娣等91对花刺参dPGAG的提取即是以4296乙醇分离，而沈鸣等【删采用65的L醇分离糙海参多糖，李海棠等【111则结合使用季胺盐、乙醇和醋酸钾沉淀分离玉足海参多糖。离子交换色谱法的分离原理是根据离子特性的差异，如HGAG中己糖醛酸的羧基与sog一的取向、类型及数量差异，用不同离子强度的NaCl溶液洗脱而分离021。其相对于其他许多分离方法的优点在于上柱前不必浓缩，色谱柱本身从溶液中吸附多糖，从而起到浓缩作用。层前，许多商业化离子交换树脂，尤其是多糖基离子交换
34、树脂已在HGAG的分离中应用。如DE-52-纤维素【l”，DEAESephadex14l，Q-FFSepharose151等等。另外，609代发展起来的凝胶过滤色谱、70年代发展起来的亲和色谱以及近年来兴起的制备性高效液相色谱技术都已用于HGAG的提取分离，并已取得了很好的效果。但是由于HGAG分子量的不均匀性、硫酸化程度的不致性、显微结构的不均匀性以及残基数量的多变性，目前尚难将提得绝对意义上“纯”的HGAO。6不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较O32海参多糖化学组成分析0321 HGAG的分析与检测HGAG的测定(定性、定量)主要采用一些化学方法，如：组织化学和物理化学方法。组织化学方
35、法常用的是染色法，如：阿利新蓝(Alican blue)染色法、天青I染色(azure A)、甲苯胺蓝等。由于GAG的染色没有特异性，所以难以得到准确的结果。比色法和分光光度法常用于GAG的共同定性定量分析中。另外还有同位素标记法【、凝胶色谱法、电泳法等。0322单糖组分的测定 GAG的二糖重复单位是由氨基己糖、己糖醛酸通过糖苷键连接而成，在氨基己糖与己糖醛酸上还带有一些取代基团，如：硫酸基(一s042-)、乙酰基(一Nr)等。在进行单耱组分的测定之前，必须先用酸、碱或酶进行水解，将GAG大分子分解成单耱片断、取代基团和氨基酸片段三部分。其中的单糖片断可分为碱性单糖(HexNH)、中性单糖和酸
36、性单糖(HexUA)。碱性单糖包括游离的氨基己糖和N一乙酰氨基己糖，最常用的检测方法有Elson-Morgan法、Morgan-Elson法、Wanger法及其改进方法。中性单糖的测定常用的方法有比色法，如：苯酚一硫酸法、蒽酮比色法、卜半胱氨酸一硫酸法等。现在已有多种自动分析仪器出现，给中性单糖的测定带来了方便，如：气相色谱。酸性单糖(已糖醛酸)的测定方法有Dische法及其改进方法Bitter法和Nelly法。常用的还有咔唑一硫酸法frn。03，23取代基的测定对于GAG中的硫酸基，通常采用明胶一氯化钡法进行鉴定，另外还有：比重法、滴定法、电导率法和比浊法等，但都不如用4一氯一4一联苯胺进行
37、分光光度法灵敏度高。电泳法也可用于完整GAG分子中o-和N_硫酸酯基的测定(低于l|l g)主要是根据电泳迁移率与硫酸基组成比例来进行分析的。对于乙酰基的测定，可采取气相色谱法(6c)、核磁共振波谱法(1H NMR)等。032，4国内外研究进展国内外有关研究表明海参中酸性粘多糖基本上由氨基半乳糖、葡萄糖醛酸，岩藻糖和硫酸基组成，现将几种海参多塘的化学组成9,lg铡归列于表0-3。7不同海参多塘提取分离及化学组成分析比较表o_3不同海参多塘的化学组成(gloog)Table0-3Chemicalcomponentofpolysaccharidesfromdifferentseacucumbers
38、。：(moVm01)033海参多糖结构分析对多糖结构的分析测定是研究其生物活性的基础。而糖的高级结构是以级结构为基础的，但与蛋白质或其它大分子不同的是，糖链的一级结构包括更广泛的内容，要分析多糖的一级结构必须包括以下几个内容：相对分子质量、糖基组成及各种组成单糖的分子数比例、单糖构型、单糖的连接次序、异头构型、取代基情况、以及糖链与非糖链的连接等。GAG结构分析的方法也有很多。测定糖链一级结构的方法见表O-4。表O-4测定糖链一级结构的常用方法Table 0-4 The analysis methods ofsaccharides structure解决的问题 常用的方法相对分子质量的铡定单糖
39、组成和分子比例毗喃环或呋喃环形式连接次序凝胶过滤法，MS，蒸气压法等部分酸水解，完全酸水解，纸色谱，GcIR部分酸水解，糖苷酶顺序水解，啪t8不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较解决的问题 常用的方法2。82异头异构体 糖苷酶水解，NMR，IR羟基被取代情况 甲基化反应一气相色谱，高碘酸氧化，NMR。IR糖链2肽链连结方式 单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、肼解反应0331化学方法水解法：在进行多糖链分析时，水解法是最基本的方法。水解法包括完全酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。完全酸水解是将多糖与强酸(硫酸、盐酸)在一定温度(80-100X2)进行水解(410 h)。水解后可采有纸色谱(Pc
40、)、薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和离子色谱法(IC)进行分析。部分酸水解是利用多糖链中部分糖苷键如呋喃型糖苷键、位于链末端的糖苷键和支链中的糖苷键易水解脱落，而构成糖链的主链重复结构的部分和糖醛酸等对酸水解相对稳定的特点，将多糖进行部分酸水解后，经醇沉、离心，将上清液与沉淀物分别进行分析，根据所得到的一些小片段可推测多糖链的一些结构特点。乙酰解主要是将多糖乙酰化，可进行单糖组成分析。目前应用较好的是甲醇水解，多糖在HCl-CH30H溶液中甲基化，形成甲基糖苷，经Gc或ttPLC分析，可得到单糖的组成。甲醇水解虽然得到不同形式的单糖，但得率高，所得图谱清晰，分辨
41、率高。高碘酸氧化法：高碘酸可以选择性地断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛，甲醛或甲酸，根据反应的定量进行，通过测定高碘酸的消耗量及甲酸的释放量，可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度、支链多糖的分支数目等。但反应必须在控制条件下进行，以防止发生超氧化反应。Smith降解：将高碘酸氧化产物用硼氢化钾或硼氢化钠还原成稳定的多羟基化合物，经酸水解后，用纸层析或Gc鉴定水解产物，由降解产物可推断糖苷键的位置。甲基化反应(改良Hakomori法)：多糖在无水二甲亚砜(DMso)作用下，各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，从而将糖苷键水解，水解后得到的化合物其羟基所在的位置即为原来单糖残基
42、的连接点。同时根据不同甲基化单糖的比例可以推测出这种连接键型在多糖重复结构中的比例。水解产物经Gc或GcMS分析。由于GAG中含有酸性单糖(不溶于DMSo)，进行甲基化之前必须先将其乙酰化，乙酰基在反应过程中会自动脱落而不影响结果。一般是将多种方法结合起来进行推定糖9不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较苷键的位置和糖链上取代基的位置。0332生物学方法多糖裂解酶法在酸性粘多糖的结构研究与组成分析中已得到了广泛的应用。这主要是由于糖苷酶的底物高度专一性。其中外切酶主要是针对耱链的非还原端单糖及其糖苷键的构型，应用最多；内切酶主要是用于从糖复合物中释放糖链。外切酶消化产物用气一液色谱、纸色谱等可
43、分析测定所释放的寡糖。另外还可用同位素标记寡糖叫，观察消化前后产物的变化(纸色谱、凝胶电泳、凝胶过滤色谱阅等)，可推测糖基数。常用的糖苷酶有：软骨素裂解酶(Ac、ABc、AcII)【硼、8一半乳糖苷酶I均等，如软骨素酶AC或ASC只裂解N一乙酰氨基己糖S 14糖醛酸，肝素裂解酶只裂解N一硫酸氨基己糖q 14糖醛酸。酶法一般要借助于其它的分析方法共同分析，如在研究海鞘splicata和H,毋,rifonnJs qaGAG=糖重复单位时，就将酶法与HPLC法结合291。gazuyuki Sugahara(1996)在研究巨蟹软骨q=CS-K时，用软骨素酶AC-II降解后，结合快速离子轰击法、HPL
44、C和1H_NMR(500MHz)法分析其四糖重复单位(30l。免疫学方法：抗原与抗体会相互结合，一定结构的多糖会抑制抗体一抗原的相互结合，不同的糖(半抗原)有不同的抑制常数。当某种未知结构的糖链对抗原和抗体的结合产生了抑制，通过测定其抑制常数，再与已知结构的糖链相比较，有相近抑制常数的多糖，其结构也相似【31翊。0333物理学方法红外光谱法(R)：是有机化学元素和高分子化学研究中不可缺少的工具。50年代开始应用于糖类的研究中，如不同糖的鉴定、定量测定(可达微克级)、取代基的识别口3】等。随着人们在研究中发现，还可识别糖的构型(D-、L一型)。如B一糖菅键890cm-1有吸收峰，两a一糖营键在8
45、40 cm-1有吸收峰；毗喃糖苷键在1100-1010cm-1有三个吸收峰，而呋喃糖苷键只出现两个吸收峰；1260cm-1与1730cm-1是酯基或o-乙酰基的特征峰l强。核磁共振波谱法(NMR)：核磁共振方法是70年代才引入到多糖结构的研究中的，随着NMR技术的发展和高磁场NMR仪的出现，尤其是80年代发展起来的2DNMR技术，使得其在多糖结构的研究中得到广泛应用，且所得到的NMR谱的质量也越来越高。1H NMR谱图主要解决多糖结构中糖苷键构型问题，根据各峰的面积之lO不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较比可求得多糖中不同糖苷键的相对含量或各种残基的比例。如通常q型吡喃己糖Hl质子的6值超
46、过5Oppm,而p型则小于5Oppm321。13 c NMR谱的化学位移范围较1H NMR谱广，可达200ppm，分辨率高，与1H NMR谱不同的是，各不同残基的相对比例与峰的相对高度成正比。糖链上如发生取代，取代位置的碳的化学位移将向低场移动，即出现“苷化位移”。通过与已知单糖的碳的化学位移相对照，从而可确定糖链的连接位置。另外还可由谱图上的信号确定某些单糖的种类，如6 170-176范围内的低场信号反应有己糖醛酸的羧基或乙酰基的存在，6 16_18范围内的高场信号表明有6位脱氧糖的甲基存在。除此之外还可根据异头碳上a异构体比p异构体商场6 2-3确定异头碳的构型。80年代后期，随着2D N
47、凇甚至多维谱的出现，500MHz甚至600Mlz的核磁共振仪的投入使用，使得NIl4R技术在多糖的结构研究中起着越来越重要的作用。如COSY谱、NOESY谱、TOCSY谱以及HOHAHA谱p4】等都已用于糖链的结构分析中。质谱(Ms)：质谱技术由于其高度的灵敏性，而使其在多糖的结构分析中占有十分重要的位置，可用于了解多糖的相对分子质量、结构片段、反应活性等多种信息。峪，尤其是GC-MS已广泛用于糖组成分析及甲基化分析中以确定糖残基的连接方式。80年代出现的FAB-MS(快速原子轰击质谱)使得高极性、难挥发且热不稳定的糖及其混合物可直接进行分析，在测定相对分子质量的同时，可根据糖的相对分子质量计
48、算糖残基如己糖、己糖胺等的组成和数量。近年来，出现了更多、更先进的质谱技术，如电喷雾质谱(ESIMS)、基质辅助激光解吸一飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、串联质谱(MS4)瞄瞎。另外还有高效阴离子交换一脉冲安培法检测技术(HPAEPAD)【36l、X-射线衍射技术等。0334国内外研究进展Paulo ASMoura+o等371从L咖海参中提取出种海参多糖，类似硫酸软骨素的结构，但却含有大量的硫酸化dL-岩藻毗喃糖分支，两种岩藻毗喃糖残基通过l一4或和1-+2糖苷键连接在B胪葡萄糖醛酸残基的3位上。其可能结构见图o_l。不同海参多糖提取分离及化学组成分析比较童orOS03“or01tR
49、-S仉J图o_1 L gr由ea海参多糖可能结构F唔0-1 Hypothetic structure ofpolysaccharide from砌Kariya等闱从刺参阿印铆缸馏体壁中分离出两种酸性粘多糖，也含有带有岩藻糖支链的硫酸软骨素结构。这种硫酸软骨素的岩藻糖支链由两个岩藻糖以1-3糖苷键连接在葡萄糖醛酸分支的o-3位上，而剩余的岩藻糖支链可能连接在N-乙酰氨基半乳糖的旷4和或o-6位点上，其可能结构见图0-2(a)。分支结构(R)分为两类，A和B，取决于内部岩藻糖的硫酸化程度(R3)。图o-2(b)给出的是单硫酸取代和未经硫酸取代的核心二糖单位的结构和组成分布，这种二糖单位包含有定位在N-乙酰氨基半乳糖分支上的岩藻糖支链。移疹电电心龟1L一图O_2 Sjaponicus多糖可能结构Fig0-2
