中药鉴定学新技术新方法研究进展.pdf

1、综述 中药鉴定学新技术新方法研究进展陈士林1*， 郭宝林1， 张贵君2， 严铸云3， 罗光明4， 孙素琴5，吴和珍6， 黄林芳1， 庞晓慧1， 陈建波5( 1. 中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室 ， 北京 100193;2. 北京中医药大学 中药学院 ， 北京 100102; 3. 成都中医药大学 药学院 ， 四川 成都 611137;4. 江西中医学院 ， 江西 南昌 330004; 5. 清华大学 化学系 ， 北京 100084;6. 湖北中医药大学 ， 湖北 武汉 430065) 摘要 作者对近 20 年中药鉴定学研究和应用的新技术

2、 、新方法进行了综述 ， 介绍和评述了每种技术或方法的原理 、特点 、应用实例及发展方向 ， 探讨了现有新技术在鉴定中的客观性和准确性 。DNA 条形码技术鉴定能力较强 ， 在鉴定没有背景信息的中药样品及在方法通用性和可数字化方面具有优势 ， 应用前景广阔 。光谱鉴定具有指纹特征性 ， 在中药材及饮片的质量管理和鉴定中具有一定的实用性 。显微鉴定新技术 、色谱鉴定 、特定引物 PCR 标记鉴定 、生物效应鉴定 、DNA 芯片以及仿生技术等其他技术在特定中药鉴定中将发挥重要作用 。 关键词 中药鉴定 ; 分子鉴定 ; 化学鉴定 ; 性状鉴定 ; 显微鉴定 稿件编号 20120116004 基金项

3、目 国家自然科学基金重点项目 ( 81130069) ; 卫生行业科研专项项目 ( 200802043) 通信作者 *陈士林 ， 博士生导师 ， 从事中药资源学研究 ， Tel:( 010) 62899700， E-mail: slchen implad. ac. cn中药材是中药饮片 、中药提取物和中成药的原料 ， 它的前端是药用植物 、药用动物 、药用矿物及其特定的药用部位 ，或者称为中药材的基原 。中药鉴定学研究的主要内容为中药材及其基原的鉴定 ， 包括鉴定方法和鉴定标准 ， 有些鉴定方法可以沿用到饮片 、提取物和中成药 。中药材的准确鉴定是中医药事业运行和发展的基本环节 ， 一直备受关

4、注 。国家药品标准对中药材的基原 、鉴定方法和质量标准进行了规定 ， 要求基原须准确无误 ， 鉴定方法要实用有效 ， 标准正确合理 1。对于常用中药材的基原问题 ， 科学家通过本草考证 、产地 、市场和临床用药情况调查 ， 并主要依据分类学研究将来源物种确认 ( 矿物药主要依据矿物学 ) ， 限定了药用部位 ，基本澄清了混乱 ， 据此建立了国家相关药材标准 。然而 ， 药材市场处于动态变化中 ， 基原变化和新的药材类型 ( 如栽培品 、进口品种 、新的中药材品种等 ) 不断出现 ， 鉴定研究工作仍不能松懈 。此外 ， 我国民族药基原混乱问题至今仍未全面解决 ， 需要重视 。随着人类对天然药物的

5、认识和利用 ， 形成了药物鉴定知识 。中药材鉴定方法的发展则与中医药的发展同步 ， 体现在历代医药学典籍中 。西方生药学鉴定方法于 1930 年引入中国 ， 形成了中药鉴定学的基原 、形态 、显微和理化四大鉴定方法体系 。而后我国在显微鉴定方法中创新性地应用了粉末鉴定 ， 目前薄层方法已成为理化方法的主流 2。中药材鉴定是依据能够良好表征药材特殊性或特征性的性状 ， 以有效而准确地区别药材 ， 特别是易混品和伪品 。因此 ， 方法的有效性 、准确性 、便捷性和实用性是鉴定的新目标 ， 而新技术 、新方法 、新的特征类型的引进和应用则是实现上述目标的重要途径 ， 最终实现鉴定方法的客观化 、数字

6、化和网络化 。本文对近 20 年发展起来的中药鉴定学新技术和新方法进行了综述和总结 。对各类技术 、方法进行了介绍和评述 ，并对其发展方向进行了展望 。1 分子鉴定技术中药分子鉴定一般是指依据大分子 ( 核酸和蛋白 ) 特征的鉴定 。按鉴定特征可分为核酸分子鉴定和蛋白质分子鉴定两大类 ， 由于中药样品的特殊性 ， 核酸分子鉴定主要集中于 DNA 分子鉴定 3。1. 1 DNA 分子鉴定传统鉴定方法主要依据性状特征差异进行鉴定 ， 而 DNA分子鉴定技术则依靠反映生物个体 、居群或物种基因组中具有差异特征的 DNA 片段来鉴定 ， 不受环境饰变影响及经验的限制 ， 在中药材品种鉴定上具有一定优越

7、性 。分子生物学技术的迅猛发展促进了 DNA 分子标记鉴定技术的诞生 、发展和在中药鉴定中的应用 。中药 DNA 分子鉴定经历了以 RFLP， RAPD 和 DNA barcoding 技术为代表的3401第 37 卷第 8 期2012 年 4 月Vol. 37， Issue 8April， 20123 个阶段 ， 形成了基于分子杂交信号 、PCR 扩增指纹 、核酸序列分析的三大 DNA 鉴定技术体系 3。基于序列分析的 DNA条形码技术是目前影响较大 、应用较广泛的 DNA 鉴定技术 。1. 1. 1 DNA 条形码鉴定技术 DNA 条形码是指利用基因组中一段公认标准的 、相对较短的 DNA

8、 片段作为物种标记而建立的一种新的生物鉴定方法 ， 由加拿大分类学家 PaulHebert 于 2003 年首次提出 4。该方法通过筛选确定通用条形码 ， 建立条形码数据库和鉴定平台 ， 通过生物信息学分析方法分析比对 DNA 数据 ， 进而对物种进行鉴定 。DNA 条形码鉴定快速准确 、有望实现自动鉴定 ， 是传统生物鉴定方法的有效补充 ， 因而受到了国内外学者的广泛关注 ， 目前已成为物种鉴定和分类的研究热点 5-7。与其他分子鉴定方法相比 ， DNA 条形码鉴定具有三大优势 : 鉴定结果可重复性良好 ; 方法通用性强 ; 可构建统一数据库和鉴定平台 ， 易于推广和标准化 。近年来 ， 中

9、药 DNA 条形码鉴定研究得到快速发展 。中国学者通过大样本量系统研究 ， 于 2010 年提出将 ITS2 作为药用植物标准 DNA 条形码 ， psbA-trnH 作为 ITS2 的补充序列 8。同时 ， 通过对 GenBank 数据库中所有植物和动物 ITS2序列的分析 ， 发现 ITS2 不仅对植物具有较高的鉴定效率 ， 对动物的鉴定成功率也高达 91. 7%， 进而建议 ITS2 可作为动物通用条形码 COI 的补充序列 9。目前 ， ITS2 已成功应用于豆科等多个科属药用植物及药材鉴定 10-15。psbA-trnH 序列也在石斛属等药用植物鉴定中得到了较好应用 16-24。鉴于

10、以上研究成果 ， 陈士林等 25建立了以 ITS2 为核心 、psbA-trnH为补充序列的植物类药材 DNA 条形码鉴定体系和以 COI 序列为核心 、ITS2 为辅助序列的动物类药材 DNA 条形码鉴定体系 ， 并编著 中药 DNA 条形码分子鉴定 一书 。同时 ， 为加快中药 DNA 条形码研究和应用步伐 ， 中国医学科学院药用植物研究所建立了药用植物 DNA 条形码数据库 ， 数据库网址为 http: / /its2-plantidit. dnsalias. org/ 和 http: / /psbA-trnH-plantidit. dnsalias. org/。随着数据库的充实和扩大

11、， 相信在不久的将来 ， 便可通过数据库对中药材进行快速检索和鉴定 ，应用前景广阔 。1. 1. 2 基于 PCR 的分子鉴定技术 随机和简单限定引物的PCR 标记技术 : 该类技术不需要知道研究对象的 DNA 信息 ，采用随机引物对模板 DNA 进行扩增 ， 如 RAPD( random am-plified polymorphism DNA) ， AP-PCR 等 ; 或对引物进行简单限定 ， 如 AFLP( amplified fragments length polymorphism) 26， IS-SR( inter-simple sequence repeat) ， DALP( d

12、irect amplification oflength polymorphism) ， SRAP( sequence related amplified poly-morphism) ， TRAP( target region amplified polymorphism) 等 3。目前主要用于生物遗传关系和多样性分析 27-28。在中药鉴别方面也有一些报道 ， 如 PC Shaw 等利用 RAPD 技术进行了人参 、西洋参 、三七及其混伪品的鉴别研究 29。该类标记技术可通过特异条带法和聚类分析法来实现中药材的鉴定 ， 但方法的稳定性和可重复性需要提高 。引物进行简单限定进行扩增的方法要随

13、行实验和比较 ， 通用性差 。因此 ， 该类方法较难满足良好的鉴定要求 。特定引物的 PCR 标记技术 : 该类方法需要事先知道研究对象的 DNA 序列信息 。如 SCAR( sequencing characterizedamplified region，) 是根据 RAPD， AFLP， ISSR 等方法得到的差异条带 ， 进行测序 ， 设计引物 ， 获得特异鉴别条带 。SSR( sim-ple sequence repeat) 是依据已知研究对象简单重复序列类型以及两侧序列 ， 用两侧序列作为引物 ， 扩增其重复序列 ， 根据不同对象的重复次数不同获得不同长度的条带进行鉴定 。杨维泽等对

14、 dbEST 数据库中人参属植物人参 、西洋参和三七的 EST 序列进行搜索和 SSR 引物设计 ， 能有效扩增三七的SSR 序列 30; 丹参也有相关的研究报道 31。位点特异性PCR 鉴定 ( allele-specific diagnostic PCR) 是对已知待鉴别中药与混伪品基因序列进行比对分析 ， 确定正品的特异性变异位点 ， 引物设计时将该位点互补碱基设计在引物 3端最末端( 或在靠近 3端的 2 6 个碱基引入变异碱基 ， 增强扩增的特异性 ) ， 正品可扩增出含有特异性突变位点的基因扩增片段 ，混伪品没有 ， 从而实现中药材的真伪鉴别 。该技术在石斛 32、鳖甲 33、紫苏

15、 34等中药材品种的鉴别中得到了广泛应用 ， 2010 年版 中国药典 中也收录本方法为蕲蛇和乌梢蛇的分子鉴定方法 。1. 1. 3 基于分子杂交的 DNA 分子技术 RFLP( restrictionfragment length polymorphisms) 是依据序列差异并产生特定的限制性内切酶酶切位点 ， 从而导致酶切片段长度的变化或片段数量的增减 ， 进行鉴定 。该项技术首次应用到北沙参基原植物珊瑚菜 Glehnia littoralis 不同居群的鉴别 35， 随后应用到柴胡 36等药材或其基原植物的鉴别中 。因该方法所需DNA 的量较大 ， 对 DNA 的质量要求较高 ， 限制了

16、其广泛应用 。在保留酶切方法 ， 简化杂交技术的基础上建立了 PCR-RFLP( PCR-restriction fragment length polymorphism) 技术 。目前已有灵芝 37、绞股蓝 38等药材的 PCR-RFLP 鉴别方法 。DNA 微阵列 ( DNA 芯片 ) 是将不同中药的特异性基因片段作为探针 ， 固定在支持物上制成芯片 ， 通过待测药材的DNA 与基因芯片上的基因片段发生互补结合 ， 从而实现该中药的鉴定 。Caries 等 39利用基因芯片对几种有毒中药进行了鉴别 ， 蔡佩欣 40将不同种属多态性片段的特异性寡核苷探针制成芯片 ， 建立了贝母类药材基因芯片

17、检测方法 ; Yan-Bo Zhang 等 41建立了 16 个不同种属石斛的检测基因芯片 ，有效检测出 中国药典 收载的 5 种石斛 ， 并能检测复方中的金钗石斛 。DNA 芯片技术具有高效 、快速 、准确的优势 ， 但由于芯片制作 、检测仪器设备较昂贵 ， 过程复杂 。因此在中药材的鉴别应用受限 。1. 2 蛋白质标记技术1. 2. 1 抗血清鉴别技术 抗血清鉴别技术是利用中药含有的抗原性物质 ， 如蛋白质 、多糖等物质 ， 制备特异性的抗体 ，4401第 37 卷第 8 期2012 年 4 月Vol. 37， Issue 8April， 2012采用免疫酶联吸附法 ( ELISA) 或抗

18、体酶免疫试验 ( SAEIA) 等免疫学测定方法鉴别中药 。Kitagawa Tsunehiro 等采用 SAE-IA 法对半夏 、茯苓等进行了鉴别 42， 阿胶及其代用品也采用抗血清鉴别技术鉴别 43。1. 2. 2 蛋白质电泳鉴别 利用中药中所含蛋白质分子大小 、形状或所带电荷差异 ， 通过电泳分离而鉴别中药的方法 ，常见有聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( polyacrylamide gel electrophore-sis， PAGE) 和毛细管电泳 ( capillary electrophoresis， CE) 。前者有用于一些果实种子 、动物类药材鉴别的实例 44-45。后者近年来在中药的

19、鉴别研究中报道较多 46-47。1. 2. 3 同工酶鉴别技术 同工酶鉴别技术是基于待鉴定中药的同工酶 ( isozyme) 分子结构 、活性和免疫原性等方面的特异性 ， 采用酶活性分析和电泳检测的技术 ， 鉴定不同中药品种的方法 。李明利用植物鲜叶中的过氧化物同工酶 ， 成功鉴别了当归及其混伪品欧当归 、独活 48。也有报道用同工酶鉴别藤茎类药材 49。1. 2. 4 蛋白飞行时间质谱鉴定技术 蛋白飞行时间质谱鉴定技术是利用飞行时间质谱 、荧光标记技术 ， 对中药所含肽和蛋白质种类和组成进行分析 ， 从而鉴定不同中药材的一种鉴定技术 。王若光等用商品蛋白芯片结合飞行时间质谱的方法 ， 建立了

20、地龙 50、羚羊角 51等动物类中药蛋白质 /肽成分质量指纹图谱的鉴别方法 。1. 3 发展方向经过 20 多年的研究和探索 ， 分子鉴定技术在中药基原植物和药材鉴定方面取得了突出成绩 。DNA 条形码技术为分子鉴定技术的新方向 ， 在中药鉴定中已经表现出巨大的应用潜力 ， 有望实现中药鉴定标准化和数字化 。随着中药 DNA条形码鉴定研究的不断深入 ， 以下几方面将逐渐成为今后研究的热点 : 中药材 DNA 提取试剂盒以及 PCR 扩增试剂盒的研发 ; 制定中药材 DNA 条形码鉴定的技术标准 ， 完善条形码数据库和鉴定平台 ; 建立 DNA 条形码转换为二维码的技术标准 ， 并将其推广应用到

21、中药生产 、流通和药品监管等领域 。当然 ， 由于中药品种复杂多样 ， 其他分子鉴定方法 ， 如蛋白鉴定方法 、基因芯片 、特异引物 PCR 鉴定技术等 ， 也将在中药材鉴定中发挥重要作用 。2 化学鉴定技术中药化学鉴定的物质基础是其所含的化学成分组 。中药材所含成分复杂多样 ， 化学鉴定通常选择少数具特征的化学成分 ， 或者以化学成分的整体构成特点作为鉴定依据 。早期的中药理化鉴定多依据一类成分具有的化学特性 ， 如特定的显色反应等 。TLC 方法采用对照品 、对照药材或对照提取物进行随行对照鉴定 ， 得到应用和普及 。随着色谱分离 、分析技术的发展 ， HPLC， GC， HPCE 等方法

22、及与光谱联用技术的发展 ， 可更精细和准确地反映中药材化学组分数和量等特征 ， 成为中药材鉴定和质量控制的有效方法 。而以混合组分整体特征分析见长的光谱技术 ， 如红外光谱 、X-衍射光谱 、紫外光谱 、荧光光谱 、拉曼光谱等技术在中药材鉴定中也显露出其独特的优势 。中药材所含化学成分复杂 ， 有些相似来源药材的光谱或色谱等化学指纹图谱差异很小 ， 不易直接观察 。因此 ， 需要借助化学计量学技术 ， 对大量样本的化学指纹图谱进行统计分析 ， 寻找出相似药材之间微小但是有规律的特定差异 。主成分分析 ， SIMCA， PLS-DA， 支持向量机 、人工神经网络等多种模式识别方法均可用于中药材化

23、学指纹图谱的分析 ， 从而建立客观准确的药材鉴定方法 。2. 1 光谱鉴定技术2. 1. 1 中红外光谱鉴定技术 红外光谱按照波长范围的不同可分为中红外光谱 ( MIR) 、近红外光谱 ( NIR) 和远红外光谱 ( FIR) ， 尤以中红外光谱技术最为成熟 、应用最为广泛 ， 是目前公认的化合物 “指纹光谱 ”技术 ， 也是各国药典普遍规定化合物鉴别的关键方法 。红外光谱仪器技术和化学计量学方法促进了中红外光谱在复杂混合物鉴定和质量研究中的应用 ， 中药材鉴定即是其中重要的应用领域 。红外光谱具有极强的指纹特征性 。混合物的红外光谱为其所含成分的光谱特征叠加 ， 混合物所含组分种类越多 ，其

24、红外光谱上各种谱峰的叠加就会越严重 ， 导致不同混合物的鉴别变得困难 。在混合物红外光谱的解析过程中 ， 会遇到与纯化合物红外光谱解析不同的难题 。针对混合物红外光谱解析的目的与难题 ， 孙素琴等 52-58根据混合物红外光谱宏观指纹特征 ， 建立了中药材 “红外光谱三级鉴别法 ”， 利用红外光谱 、二阶导数红外光谱和二维相关红外光谱增强药材光谱特征 ， 根据叠加峰进行成分解析 ， 借助化学计量学统计方法进行鉴定识别 。该方法不仅可以准确鉴定不同的中药材( 不同来源和正伪品 ) ， 还能实现不同生长环境 、采收时间 、加工处理药材等的鉴定 。中红外光谱用于中药材鉴定有着诸多优势 : 反映样品的

25、整体化学信息 ; 多种附件技术的使用 ， 可以实现各种形态样品的快速 、无损检测 ， 而且样品可无需分离提取等预处理过程 ; 与化学计量学结合 ， 可在快速检测的基础上 ， 实现快速鉴定 ; 仪器通用 ， 操作简便 ， 成本低 ， 无污染 。重复性好 ， 可建立统一规格的化学图谱库 ， 用于检索和实现网络在线鉴定 。但使用图谱库进行鉴定具有一定的局限性 ， 一方面 ， 不同的采收 、加工 、处理等可能较大影响药材总体成分变化 ， 另一方面很多近缘物种可能在图谱总体特征上变化较小 ， 因此图谱库需要尽可能涵盖药材各种成分变化的样品谱图 ， 也需要根据药材具体情况 ， 采用二阶导数光谱 、二维相关

26、图谱 、制备提取物图谱或摘选特异区段比较等方法进行进一步鉴定 。中红外光谱已大量应用到中药材和中药饮片的鉴定中 ，孙素琴等测试了 200 多种对照药材的红外光谱 、二阶导数红外光谱和二维相关红外光谱 55。刘军等 59使用中红外光谱法建立八角茴香及其伪品莽草和红茴香的鉴别方法 。周群等 60也使用中红外光谱与二维相关光谱鉴别了药用西宁大5401第 37 卷第 8 期2012 年 4 月Vol. 37， Issue 8April， 2012黄与伪品华北大黄 。此外 ， 红外光谱三级鉴别法还成功用于人参 61、阿胶 62、淫羊藿 63等多种中药材的鉴定 。2. 1. 2 近红外和拉曼光谱鉴定技术

27、近红外光谱法也可用于中药材鉴别 。由于存在谱图影响因素多 、背景复杂 、谱峰重叠等限制 ， 近红外光谱的谱图差异不仅源于化学成分的不同 ， 也可能源于粒度 、密度等物理因素的变化 。因此 ， 样本间化学差异较小时 ， 近红外光谱主要用于物理性质一致的大量样本的统计分析 ， 例如不同产地相同物种药材的识别以及药材中常量成分的定量分析 ， 而在不同物种中药材鉴定方面应用较少 。刘浩等 64使用二维相关近红外光谱鉴别了香加皮和五加皮 ， 沈海龙等 65利用近红外漫反射光谱法鉴别了地骨皮和伪品荃皮 、大青根皮 。拉曼光谱也是一种分子振动光谱 ， 可以用于中药材的鉴定 ， 所提供的信息与中红外光谱具有互

28、补性 。若中药材含有可产生荧光的成分 ， 可能导致无法观察到药材的拉曼信号 ，因此需要使用波长较长的激发光源 ( 如波长为 1 064 nm 的Nd: YAG 激光 ) 。孙素琴等 66首次使用傅里叶变换拉曼光谱仪直接测定了党参 、茯苓 、山药等 23 种植物药材 。刘蓬勃等 67使用傅里叶变换拉曼光谱成功鉴别了八角茴香及其伪品莽草和红茴香 。2. 1. 3 X-射线衍射图谱鉴定技术 X-射线衍射图谱为 X-射线受到原子核外电子的散射而发生的衍射 ， 而不同原子排列的晶体会产生特定的衍射图像 ( 图谱 ) ， 一般用于推测晶体结构 。中药材的 X-衍射图谱应为其所含各种成分中所有原子的衍射图谱

29、叠加后构成的特征图谱 。由衍射图形及衍射峰值构成 ， 具有指纹性 ， 可用于中药材的鉴定 。中药材衍射图谱由弥散峰 ( 所含的大量淀粉 ， 多糖 ， 纤维 ， 蛋白等大分子成分产生 ) 和晶体物质锐峰 ( 如草酸钙 、蔗糖等个别晶态物质 ) 两类峰叠加而成 。X-射线衍射首次于 1997 年运用于中药材的鉴定 68， 其后进行了植物 、动物和矿物多种药材的鉴定研究 。比较而言 ， 鉴定效果较好的是矿物类中药 ， 如含钙类矿物药的鉴定 69、珍珠粉和贝壳粉的鉴定 70等 ; 植物药次之 ， 如中药蛇床子 71等 ; 全动物体类药的特征性稍差 72。2. 1. 4 其他光谱鉴定技术 紫外 -可见吸

30、收光谱是一种常见的光谱分析方法 。使用紫外光谱对中药材进行测试时 ， 需要先用一定的溶剂对药材进行提取 。中药材成分复杂 ， 单一溶剂提取物很难反映药材的整体化学成分 ， 也不易鉴别不同物种的药材 。因此 ， 袁久荣 73提出了 “中药鉴别紫外光谱谱线组法 ”: 分别使用石油醚 、氯仿 、乙醇和水 4 种极性不同的溶剂对中药材进行提取 ， 将这 4 种溶剂提取物的紫外光谱作为该药材的鉴别特征 。然而药材提取物的紫外光谱往往存在吸收峰较宽 、重叠严重等问题 ， 袁久荣等 74进一步提出了“中药鉴别导数紫外光谱谱线组法 ”， 通过导数光谱可增强谱图特征性 。紫外灯照射下的荧光性质也可鉴别不同物种的

31、药材 75， 但该方法主观性强 、特征性差 。采用三维荧光光谱可提供药材成分的更多信息 ， 便于寻找不同物种药材的差异 。魏永巨等 76-77使用三维荧光光谱分别鉴别了白花前胡与紫花前胡 、山豆根与北豆根 。核磁共振谱 、太赫兹光谱等其他光谱和波谱方法也用于中药材的鉴别研究 。秦海林等 78-79使用核磁共振氢谱对天麻 、黄连等药材进行了鉴别 。陈艳江等 80使用太赫兹光谱和支持向量机方法对炙甘草和生甘草 、南柴胡和北柴胡 、山豆根和北豆根进行了鉴别 。但是受到仪器成本等方面的限制 ， 这些方法的推广普及有一定的难度 。2. 1. 5 光谱鉴定技术的发展方向 紫外光谱 、荧光光谱和核磁共振谱的

32、测试常需对药材进行提取分离处理 ， 而红外光谱和拉曼光谱可直接测试药材 ， 拉曼光谱和近红外光谱对未经预处理的样品不需与仪器本身接触也可测试 ， 还可通过光纤等方式进行原位在线检测 。因受到荧光背景的干扰 ， 很多中药材的拉曼光谱特征性较差 ， 使其应用到中药材鉴定受限 。近红外光谱技术适宜于物化性质近似的大量样本的统计分析 ， 中红外光谱既可进行中药材定性鉴别又可以进行常量成分定量分析 ， 样本数量可多可少 ， 样本成分差异可大可小 。中药材中红外光谱鉴定技术的未来方向是 : 建立大样本量的光谱数据库 ， 建立各类和各种中药材的中红外光谱快速鉴定平台 ; 研究建立企业 、行业和国家标准等多级

33、鉴定标准 ;将中药材性状鉴别与红外光谱分析相结合 ， 找出中药材性状特征与红外光谱特征的关系 ， 对中药材进行更全面的鉴别 。2. 2 色谱鉴定技术色谱技术是中药化学成分分离分析及中药质量评价和控制的核心技术 ， 其中薄层色谱最早应用于中药的理化鉴定 ， 目前 HPLC 为代表的高效色谱技术逐渐成为中药鉴定主要技术 ， 其他还有气相色谱法 ( GC) 和高效毛细管电泳( HPCE) 等 。高效色谱鉴定技术应用于中药材鉴定源于 “指纹图谱 ”概念 ， 也即色谱技术对中药所含化合物进行分离和检测 ， 得到表征各类成分的系列色谱峰 ， 通过色谱峰的数目 、峰位和峰高度的特异性构建特定化学指纹图谱 ，

34、 该指纹图谱反映出研究对象的精细化学构成特征 ， 可用于中药的鉴定 。理论上不同物种具有不同的化学色谱指纹 ， 但生物的代谢产物受环境 、生长发育阶段 、不同生物部位等因素的影响较大 ， 同时色谱技术本身的分离和侦测能力和限制 ， 以及样品前处理的影响 ， 导致有时同一物种的药材指纹图谱差别较大 。因此 ， 指纹图谱用于中药鉴定时需大样本总结物种的共性特征 ， 不同的中药材品种鉴定标准会有一定的差异 。2. 2. 1 HPLC 鉴定技术 HPLC 以液体为流动相 ， 采用高压输液系统 ， 将不同极性流动相泵入装有固定相的色谱柱 ， 在柱内各成分被分离后 ， 进入检测器进行检测 。利用梯度洗脱技

35、术可将药材中的各类成分分离结果表征在一张色谱图上 。不同的色谱柱 ( 固定相 ) 、流动相和色谱系统对化合物的分离6401第 37 卷第 8 期2012 年 4 月Vol. 37， Issue 8April， 2012程度产生一定的影响 ， 获得的色谱指纹具有某些差异 ; 不同的检测器和检测参数也产生不同的指纹图谱 。HPLC 色谱鉴定技术用于中药材鉴定的优点是具有高效的分离能力 ， 可精细和准确地表征中药材小分子化学成分的数和量特征 。利用不同溶剂不同提取分离分析方法不但能消除复杂背景的干扰 ， 而且可将微量成分富集并进行表征 。利用不同的色谱柱和流动相及不同的检测系统 ， 可以获得中药材中

36、多种多类化学特征指纹 。表征有效成分或活性成分HPLC 色谱特征可与中药材的功效建立关系 。缺点是色谱指纹在种内的多变性 ， 色谱指纹图谱提供的化学信息比较精细 ， 不同中药材的鉴定特征提取和鉴定标准建立需要较大的样本量 ; 每种中药的鉴定包括了特定的固定相 、流动相和检测方法的特定组合 ， 鉴定方法上通用性较差 ;色谱指纹图谱随色谱柱的品牌型号 、色谱仪器等影响稍有变化 。HPLC 指纹图谱用于中药材和中药饮片的鉴定取得了可喜的成绩 。翟为民等 81用 HPLC 指纹图谱鉴别了人参 、西洋参和三七 。陈胡兰等 82对市场上 38 批地丁类药材的鉴别研究 ， 表明紫花地丁与其混淆品苦地丁的 H

37、PLC 指纹图谱差异大 ， 易区别 。张尊建等 83证实密花石斛 、马鞭石斛 、短棒石斛 、鼓槌石斛和金钗石斛的 HPLC-UV 指纹图谱有显著的差异 。裴利宽等 84研究了淫羊藿物种的黄酮类 HPLC 指纹图谱 ， 表明朝鲜淫羊藿 、心叶淫羊藿 、粗毛淫羊藿 、巫山淫羊藿的大部分样品具有可资鉴别的 HPLC 指纹图谱特征 ， 可用于淫羊藿药材的鉴别 。2. 2. 2 GC 鉴定技术 GC 主要是根据不同化合物在固定相和气体流动相之间的分配不同进行分离分析的手段 ， 适用于气体 、挥发性和半挥发性液体以及能够产生足够蒸气压固体的分析 85。程序升温分析方法可以获得更为详尽的成分信息 ， 用于鉴

38、定的 GC 指纹图大多是通过程序升温方法获得 。GC 指纹鉴定是针对中药中可挥发性且热稳定性的药材化学成分 ， 因此是 HPLC 指纹的有效补充 。GC 从 20 世纪 80 年代初就用于中药品种鉴别 。如金海燕等 86建立了羌活 、独活的 GC 指纹图谱 ， 研究发现羌活 、独活 GC 指纹图谱存在显著差异 ， 只需计算未知供试品与所建立共有模式间的相似度即可鉴别两者 。张广春等 87通过西红花及其伪品的 GC 色谱行为分析 ， 发现所有西红花都含有3 个特征峰群 ， 而伪品均不含有该 3 个特征峰群 ， 藉以快速鉴别真品与伪品 。2. 2. 3 HPCE 鉴定技术 HPCE 是以高压电场为

39、驱动力 ， 以毛细管为分离通道 ， 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离分析的液相分析方法 。HPCE 易于选择各种分离性的添加剂 ， 具有分析效率高 、扩散系数小和样品量小等优点 88， 可分离蛋白质 、多肽等大分子成分 ， 也可以分离小分子成分 ， 特别适合有机酸 、生物碱等带电荷物质 89。HPCE 适用于中药的水溶性成分以及蛋白等大分子成分 ， 也可以成为 HPLC 指纹的有效补充 ， 但 HPCE 方法的重复性较色谱差 。HPCE 已在中药鉴定中的应用如侯连兵等 90对三七及其混淆品菊叶三七的蛋白多肽进行了 HPCE 法的鉴别 ， 在酸性 、碱性和中性提取液中三七及其

40、混淆品都存在明显差异 。孙毓庆等 91研究了冬虫夏草与蛹虫草 、人工蛹虫草 、亚香棒草的以 HPCE 指纹图谱 ， 发现它们存在明显区别 ， 可鉴别伪品及次品 。曾艳萍等 92研究了常用中草药沙苑子的 HPCE 指纹图谱 ， 发现正品沙苑子相似度良好 ， 但与草沙苑的指纹图谱在峰数目 、峰位 、积分值等特征上有显著差异 。此外 UPLC 采用 1. 7 m 颗粒度的色谱柱填料 ， 与 HPLC相比 ， 提高了柱效 、流速 、分析时间 、峰容量和灵敏度 。叶文文等 93建立了白术的 UPLC 指纹图谱 ， 在 22 min 内标记了32 个峰 ， 样品成分整体分离度良好 ， 建立的共有指纹图谱模

41、式可有效鉴别白术的真伪 。2. 3 色谱 -光谱联用鉴定技术色谱 -光谱联用鉴定技术是具高效分离性能的色谱技术与能获取化学成分丰富结构信息的光谱技术相结合形成的系列中药鉴定技术 94。主要有高效液相色谱 -质谱 ( HPLC-MS) 、气相色谱 -质谱 ( GC-MS) 、红外光谱 -质谱 ( IR-MS) 、质谱 -质谱 ( MS-MS) 、气相色谱 -付里叶变换红外光谱 ( GC-FT-IR) 、高效毛细管电泳 -质谱 ( HPCE-MS) 等 。其中应用最广泛的是 HPLC-MS。2. 3. 1 HPLC-MS 鉴定技术 HPLC-MS 联用技术 ， 利用质谱进行成分的检测和解析 ， 提

42、高了传统检测器灵敏度和选择性 ， 可对中药样本中未知化学成分进行定性 、初步确定未知化学成分的化学结构 95。HPLC-MS 与 HPLC 相比具有适合检测分离后容易发生变化和损坏的样品或者不易分离的样品 ; 检测灵敏度提高 ;分析色谱峰所代表的化学成分结构信息 ， 使得鉴定信息具体和准确等优点 。孙萍等 96应用 LC-MS 对木通 、川木通和关木通化学成分的分析 ， 表明木通与川木通含有较多相似成分 ， 3 种药材的MS 基峰离子存在显著差异 ， 据此可鉴别 3 种木通 。Min Ye等 97对 2 种菟丝子进行了 LC-MS 分析 ， 鉴定出 50 个成分 ，南方菟丝子主要含山柰酚及紫云

43、英苷 ， 而菟丝子主要含金丝桃苷 ， 其他酚性成分亦存在显著差异 ; 根据化学成分差异可以鉴别菟丝子的不同品种 。胡岩等 98采用该法获得了八角科 17 个种 22 个果皮样品的倍半萜内酯特征成分的总离子流图和质谱图 ， 能够很好地表征八角科植物果皮中倍半萜内酯成分的特点 ， 色谱图特征可有效鉴别原药材或药材粉末 。2. 3. 2 其他色谱 -光谱联用技术 GC-MS 是目前分析和鉴别具有挥发性 、半挥发性成分中药的首选技术 。如 RuijingPan 等 99采用 GC-MS 结合指纹图谱以及化学计量学方法分别鉴定了半枝莲 、耳草与半边莲中的 50， 36， 38 个成分 ， 利用7401第

44、 37 卷第 8 期2012 年 4 月Vol. 37， Issue 8April， 2012色谱相似度及主成分分析可准确鉴别半枝莲及其易混品 。L F Hu 100等采用该方法鉴别了广霍香及其替代品和易混品 。GC-FTIR 联用可分离 、鉴定各类复杂混合物 ， 实现中药鉴别 。如 Hongbin Zhu 等 101采用 GC-FTIR 联用 MS， 以 5 省的 11 个马齿苋样品为研究对象 ， 建立其指纹图谱 ， 应用聚类分析可准确鉴别来自中国北方与南方的马齿苋品种 。HPCE-MS 联用由于 HPCE 手段本身稳定性与重复性等原因 ，在中药品种鉴定中应用尚无报道 。2. 4 色谱鉴定技

45、术的发展方向色谱法及色谱 -光谱联用法因更为精细准确而具有优于TLC 的方面 ， 已经展现出巨大的应用潜力 。该方法可以同时展现化合物组分数和量的特性 ， 与药材的优劣直接相关 ， 是药材精细鉴定的必要方法 ， 但需基于大量的样本和复杂的方法学考察 ， 也可建立部分样本的数据库 。目前的研究应用报道尚未重复体现色谱鉴定技术本身的准确性和实用性 ， 需加大研究力度 ， 可以和光谱鉴定技术结合 ， 遵循 “从整体到部分 ， 先定性后定量 ”的原则 ， 建立以基于光谱指纹图谱的整体鉴别为主 ， 以某些特定成分的定性定量检测为辅的技术方法体系 。3 性状显微鉴定新技术生物的性状特征 ( 形 、色 、气

46、 、味 ) 是遗传的表现形式 ， 常具有物种的特异性 ， 可以用于中药物种的鉴定 ， 但也受环境的影响 ， 表现出一定的变异性 ， 因此发掘和确定出有效的中药材鉴别性状特征一直随着技术的进步在不断发展 。中药材性状鉴别经过我国历代医药工作者不断的积累和总结 ， 形成了丰富的鉴别经验和方法 ， 这些方法在今天甚至在以后相当长的一段时间内 ， 仍不失为实用 、快捷 、有效的中药材鉴定方法 。细胞的生物学地位确定后 ， 显微镜逐渐成为植物药鉴别的重要手段 。近代开始用生药学的方法研究中药材的鉴定 ，显微鉴定的方法和技术作为中药鉴定研究的主要内容 ， 中国药典 1977 年版开始收载显微鉴别内容 。随

47、着显微技术 、计算机技术和仿生技术等的发展 ， 电子显微镜鉴定 、三维图像鉴定 、仿生识别等方法相继应用到中药材的鉴别之中 。3. 1 仿生识别鉴定仿生识别是模仿动物的某一功能 ， 把被认识的一个个事物转化为一组数 ， 对应为某特定高维空间的一些点 ， 然后用高维空间几何方法来计算这些点的位置关系 ， 并加以对同一类事物分布点的几何计算分析和最佳化点覆盖识别 。中药材传统的感官鉴定 ， 经验和主观性强 ， 难以客观化和标准化界定 。现有的仿生识别技术可弥补这方面的不足 。3. 1. 1 嗅觉仿生 ( 电子鼻 ) 嗅觉仿生技术是动物嗅觉系统研究成果 、传感器技术与电子学和计算机技术结合的产物 ，

48、模仿人类后脑部嗅上皮细胞的工作模式 ， 实现对气味的检测 。电子鼻包含一组化学传感器阵列 ， 被封装在密闭容器中 。目标混合物 ， 以气态形式进入到密闭容器中 ， 气体和传感器之间的反应引起传感器电导率变化 。每一个传感器与部分成分以独特的方式进行响应 。在阵列中 ， 每一个传感器有不同的特性 ( 如涂层 、工作温度等 ) 。因此 ， 阵列中各传感器的不同电响应 ( 即电压输出 ) 联合输出形成一个指纹图谱 ( 标记 ) 图 ， 对于特定的气味是独一无二的 。根据指纹 ( 标记 ) 图利用一定的模式识别算法即可识别出不同的气味成分 102。中药材气味的香臭浓淡 ， 是传统鉴别的重要依据 。日本

49、学者御影雅幸 103利用气味传感器成功地区分了茯苓 、牡蛎 、龙骨粉末 。刘红秀等 104区别了八角 、白豆蔻 、川芎 、丁香 、荆芥 、肉桂和砂仁等药材 ， 王蔚听 105对防风类 ( 防风 、云防风 、甘肃小防风 、河南水防风 ) 、柴胡类 ( 北柴胡 、小叶黑柴胡 、阿尔泰柴胡 、三岛柴胡 、海拉尔柴胡 ) 、人参与西洋参 、当归 ( 甘肃 、云南产区 ) 和掺伪药材粉末组 ( 西洋参与人参混合粉末 )进行了鉴别 。3. 1. 2 味觉仿生 ( 电子舌 ) 味觉仿生技术是模仿人类味觉细胞和受体传感的工作模式 ， 实现对液体 “味道 ”的检测 。电子舌采用类似于生物系统的材料作传感器的敏感膜 ，当类脂薄膜的一侧与味觉物质接触时 ， 膜电势发生变化 ， 从而产生响应 。传感器阵列中每个独立的传感器仿佛舌面上的味蕾一样 ， 每个独立的传感器感受一类群化学物质 106。感受到的不同