1、肿瘤相关巨噬细胞的研究进展33 基金项目:国家自然科学基金项目(30371586)临床肿瘤学杂志2007年3月第12卷第3期 Chinese ClinicalOncology, Mar. 2007, Vol. 12, No. 3 1 通讯作者, Tel: 023 - 68755626; E - mail: chenzhengtangmail. tmmu. com. cn400037 重庆 第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所章必成, 王 俊 综述, 陈正堂1 审校【关键词】 肿瘤相关巨噬细胞; 替代性活化; 血管生成; 淋巴管生成中图分类号: R73013 文献标识码:A 文章编号: 1009
2、- 0460 (2007) 03 - 0228 - 04既往多认为,巨噬细胞是抗肿瘤免疫调节过程中的一种重要细胞群,可以直接杀伤肿瘤细胞,或者通过呈递肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答从而清除肿瘤。但是近年来逐渐认识到,肿瘤间质中的巨噬细胞即肿瘤相关巨噬细胞( tumor- associated macrophages, TAM)并非发挥抗肿瘤作用,而是参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移的过程,尤其是与肿瘤血管生成和淋巴管生成密切相关。因此,研究TAM在肿瘤进程中的功能状态和动态变化具有重要意义, TAM有望成为肿瘤治疗的新靶点。1 TAM的来源自从Rudolf Virchow首次发现肿瘤组织中有大量
3、炎症细胞浸润后,有学者由此将慢性炎症和肿瘤的发生、发展联系起来。目前研究发现,炎症细胞是肿瘤间质的重要组成部分,主要包括TAM、树突状细胞、淋巴细胞和肥大细胞等。其中, TAM是肿瘤间质中数量最多的炎症细胞群,约占炎症细胞总数的30%50%左右。TAM来源于外周循环血中的单核细胞。单核细胞的招募、分化、存活和增殖组成了TAM形成的过程 1 。单核细胞的招募与许多肿瘤来源的趋化因子有关,如CC趋化因子配体2 (CC chemokines ligand 2, CCL2,又名MCP - 1 ) 、CCL3(又名M IP21) 、CCL5 (又名RANTES) 、CCL7 (又名MCP23) 、CCL
4、8 (又名MCP22) 、血管内皮生长因子( vascular endothelialgrowth factor,VEGF) 、集落刺激因子21 ( colony2stimulating fac2tor21, CSF21,又名M - CSF)和胎盘来源的生长因子(p lacenta- derived growth factor, P IGF)等。其中以CCL2 最为重要。已经在许多人类肿瘤中发现, CCL2表达与TAM浸润数量、区域淋巴结转移和临床预后呈正相关。Nesbit等 2 认为低水平的CCL2对肿瘤形成起主要作用,而高表达的CCL2则是促进TAM浸润和肿瘤生长的主要动力。当单核细胞迁移
5、到肿瘤组织后,便在肿瘤微环境中分化成为巨噬细胞,此即TAM。单核细胞的分化过程与肿瘤微环境局部缺氧、高乳酸等条件密切相关。其中,肿瘤细胞或间质细胞分泌的IL210起到了“开关”作用,它能诱导单核细胞分化成TAM而不是树突状细胞 3 。分化成的TAM可以借助多种细胞因子与肿瘤细胞共存,此过程依赖于TAM或肿瘤细胞表达的CSF21和P IGF等;在鼠类肿瘤和人卵巢癌中,CC趋_化因子受体2 (CC chemokine recep tor 2, CCR2,即CCL2的受体)表达下调也是其原因之一。2 TAM的表型特征211 巨噬细胞的活化类型 近10年来逐渐认识到在不同的环境中,巨噬细胞可以发生不同
6、性质的活化,成为具有不同分子和功能特征的亚群。活化的巨噬细胞至少包括2种类型 4 : (1)经典活化的巨噬细胞( classically activated mac2rophage, caMphi) ,又称M1巨噬细胞。caMphi需要双信号:IFN2和外源性TNF或内源性TNF的诱导剂(细菌或其产物LPS等) 。caMphi能分泌NO、反应氧中介物等杀伤分子,以及多种炎症因子( IL21、IL26、IL212、IL213和TNF等)和趋化因子CCL2、CCL3、CXC趋化因子配体9 (CXC chemokines lig2and 9, CXCL9,又名M IG)和CXCL10 (又名IP21
7、0)等 ,还能表达大量的MHC和B7分子,可以高呈递抗原,从而参与Th1型免疫应答,杀伤感染病原体和肿瘤细胞。(2)替代性活化的巨噬细胞( alternatively activated macrophage, aaMphi) ,又称M2巨噬细胞。aaMphi不需要双信号,但需要有合适的诱导剂, 如IL24、IL213、IL210、糖皮质激素、维生素D3 和TGF2等。最近, Sica等 5 将M2巨噬细胞又分为3类: (1)M2a型:刺激信号是IL24和IL213,诱导Th2型免疫反应,在过敏性反应和寄生虫感染免疫中起主要作用。( 2)M2b型:刺激信号是免疫复合物和Toll样受体或IL21
8、R 配体,介导Th2型活化和免疫调控。( 3)M2c型:刺激信号是IL210,介导免疫调控,参与基质沉积和组织修复。不过,也有作者将228 临床肿瘤学杂志2007年3月第12卷第3期 Chinese ClinicalOncology, Mar. 2007, Vol. 12, No. 3 M2b型单独命名为型活化的巨噬细胞( type 22 activated macrophage) 。还有作者将IL210 排除在aaMphi的诱导剂之外。212 TAM与aaMphi的关系 TAM的活化表型特征目前尚未得以明确。Mantovani等 1, 5, 6 根据其他作者对人甲状腺乳头状癌、卵巢癌和乳腺癌
9、的研究结果,曾指出TAM可能发生替代性活化,呈现出aaMphi的表型;它能表达高水平的巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor,MMR)和IL210,产生很少的NO和IL212,提呈抗原的能力很弱,能抑制T细胞增殖,参与了肿瘤的生长、进展和转移,以及适应性免疫、血管生成和间质形成等过程。但此观点只是停留在“假说”的层面,尚未得到相应实验的充分证明。而且,由于:(1)肿瘤本身是复杂的,目前的研究只限于少数几种; (2)在这几种肿瘤中,研究又局限于局部区域(如瘤周和瘤内,低氧区和含氧正常区) ; (3)缺乏动态的研究信息; ( 4)研究技术和手段有限等原因,若简单
10、的认为TAM即为aaMphi,则显得比较武断。但是,Mantovani等的观点仍然代表了种可能的正确方向。最近, Hagemann等 7 研究表明:与卵巢癌细胞接触共培养的巨噬细胞可以朝着与癌细胞相似的表型转化,这些共培养的巨噬细胞分泌的细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶(matrix metallop roteinase, MMP)mRNA表达均与卵巢癌细胞相似,巨噬细胞表达的MMR、清道夫受体均上调。鉴于不同活化表型的巨噬细胞所起的作用完全不同以及TAM在肿瘤间质中的重要地位,尽快明确TAM的活化表型具有重要意义。3 TAM的功能以前多认为TAM是一种重要的抗肿瘤效应细胞。1992年,Ma
11、ntovani等提出了著名的“巨噬细胞平衡假说”,认为TAM具有杀伤肿瘤和促瘤生长的双重作用。近年来,越来越多的研究 8, 9 认为, TAM参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移的过程,尤其是与肿瘤血管生成和淋巴管生成密切相关。Chen等 10 通过检测人NSCLC标本发现, TAM数量和微血管密度(micro vessel density,MVD)呈正相关,与无复发生存期负相关;将巨噬细胞和NSCLC细胞株共培养发现,后者的侵袭能力和降解基质的活性明显增加, IL28 (又名CXCL8) 、MMP29、VEGF、VEGF2C和IL26、IL26信号转导蛋白、IL27R、NF2B抑制剂、MMP21
12、等基因表达明显上调; TAM上调IL28、IL26、CSF21和MMP等均有NF2B通路的参与,此结果提示TAM可能在NSCLC的侵袭和转移过程中具有重要地位。目前,已在多种肿瘤中证实, TAM具有这样的作用。311 TAM与肿瘤发生 很早就有人发现,肿瘤形成之前常常有大量的巨噬细胞和其他炎症细胞在肿瘤原位聚集。TAM主要与一些癌前病变有关。如引起慢性萎缩性胃炎的幽门螺杆菌,可以上调胃上皮细胞释放前列腺素E2 ( p ros2taglandinE 2, PGE2) ,从而加重病灶部位的巨噬细胞浸润。这些炎症细胞可被反复激活并释放活性氧,造成组织细胞损伤、转化以至癌变 11 。另外,在结核所致的
13、瘢痕附近,有损伤和致畸作用的活化巨噬细胞,常与肿瘤被同时发现。312 TAM与肿瘤生长 在乳腺癌、子宫内膜癌和肾癌等多种肿瘤中已经证实, TAM 浸润程度与肿瘤生长呈正相关。TAM主要通过分泌以下生长因子来促进肿瘤细胞增殖和存活 12 : EGF、PDGF、HGF、bFGF和TGF2等。将TAM与部分肿瘤细胞共培养时发现, TAM分泌的生长因子能明显促进肿瘤细胞增殖;外源性去除TAM实验证实, TAM对于它们的生长是必不可少的。此外,有作者发现TAM可以通过精氨酸酶途径来促进肿瘤细胞增殖 13 。3. 13 TAM与肿瘤侵袭 TAM参与了肿瘤细胞向周围正常组织侵袭的过程。对乳腺癌和其它肿瘤的研
14、究发现 14, 15 ,TAM是通过上调蛋白水解酶(如组织蛋白酶B) 、MMP、纤溶酶、uPA及其受体等表达,破坏基底膜,溶解细胞外基质,从而增强肿瘤细胞的侵袭性。在TAM高表达MMP的过程中,C2JNK和NF2B信号通路得以激活。此外,体外实验表明,肿瘤细胞表达的CSF21可以通过促进TAM表达EGF来促进肿瘤侵袭,但其具体机制尚待进一步研究 16 。314 TAM与肿瘤转移 TAM不仅参与了原发肿瘤释放转移性肿瘤细胞的过程,而且在远处器官形成转移灶的过程中起重要作用。TAM至少通过3条途径参与了原发肿瘤释放转移性肿瘤细胞的过程 17 : ( 1) TAM增强了肿瘤细胞从原发肿瘤逃逸的活力:
15、 ( 2) TAM促进了肿瘤细胞侵入血管系统; (3) TAM表达VEGF2C促进淋巴管生成。CSF21和EGF通路参与了前2个过程。多项研究表明, TAM与远处器官转移灶的形成和生长密切相关;临床分析也证实,转移性区域性淋巴结中的TAM数量与患者预后明显相关 18 。315 TAM与肿瘤免疫抑制 TAM提呈抗原的能力很弱,能抑制T细胞和NK细胞的活化和增殖,因此难以发挥有效的抗肿瘤效应。研究表明,肿瘤细胞可以通过释放IL24、IL26、IL210、PGE2和TGF2等分子来抑制TAM的细胞毒性,而且IL210、PGE2 和TGF2 还可以抑制TAM 表达MHC 分子 19 。此外,在肿瘤局部
16、低氧的微环境中, TAM也能通过分泌PGE2、IL210和吲哚胺加双氧酶( indoleamine dioxigenase,IDO)代谢产物来产生这种抑制效应,同时分泌IL212明显减少,而后者恰恰是一种促进T细胞和NK细胞杀伤作用的重要分子。4 TAM与肿瘤血管生成和淋巴管生成的关系411 TAM与肿瘤血管生成 血管生成是肿瘤生长和转移过程中的重要事件。在多种人类肿瘤如乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、口腔鳞状细胞癌、肾细胞癌、直肠癌等组织中,人们发现TAM数量与MVD、VEGF表达呈正相关,是独立的预后因子 8 。TAM促进肿瘤血管生成是一个十分复杂的过程,其中涉及许多自分泌和旁分泌因子的作用。肿
17、瘤间质的低氧环境能够诱导TAM高表达多种促血管生成因子和生长因子 临床肿瘤学杂志2007年3月第12卷第3期 Chinese ClinicalOncology, Mar. 2007, Vol. 12, No. 3 229(如IL28、CCL8、bFGF、VEGF、PDGF、PD2ECGF、TNF2等) ,以及调控血管生成的酶(如MMP22、MMP27、MMP29、MMP212和COX22等) 。目前有关这方面的研究较多。在体外实验中, Yao等 20 将佛波酯处理的人THP21细胞或原代人肺巨噬细胞和肺癌细胞共培养后,肿瘤细胞IL28mRNA表达可增高35%;外源性IL21和TNF2可以诱导I
18、L28 mRNA上调并呈显著的剂量依赖关系,提示自分泌和旁分泌机制在肿瘤细胞表达IL28 的过程中具有重要作用。White等 21 发现,人外周血单核细胞与A549细胞共培养的培养基可以增加内皮细胞的趋化性,这与单核细胞表达IL28、ENA278和GRO等增加密切相关。Kataki等 22 认为肺癌中的TAM对肿瘤细胞的细胞毒作用非常弱,但表达高水平的PDGF,后者可能对肿瘤基质形成和血管生成具有重要作用。Junker等 23 发现是巨噬细胞而非小细胞肺癌表达的YKL240对肿瘤细胞增殖和血管生成具有重要作用。此外,Kojima等 24 发现TAM可以表达PD2ECGF从而促进内皮细胞迁移,在
19、体内其表达水平与血管生成呈正相关。412 TAM与肿瘤淋巴管生成 淋巴管生成是肿瘤发生淋巴道转移的必需事件。淋巴道转移是肿瘤发生全身转移的初始步骤,提示肿瘤预后不良。近年的研究表明,巨噬细胞参与了炎症条件下的淋巴管生成。Maruyama等 25 发现,在小鼠角膜移植(角膜发炎)后,来源于骨髓的CDllb+巨噬细胞聚集于角膜基质中,能单独形成淋巴管样结构和表达VEGF2C,从而促进小鼠角膜的淋巴管生成。Kerjaschki 26 认为炎症环境中的CDllb+巨噬细胞诱导淋巴管生成存在两条途径:(1)巨噬细胞直接转分化成淋巴管内皮细胞; (2)巨噬细胞刺激已经存在的淋巴管内皮细胞分裂增殖。由于肿瘤
20、间质实质上也是炎症环境,因此人们推测TAM可能也参加了肿瘤淋巴管生成。这个观点在近年来逐渐得到证实。Schoppmann 等 27 发现不仅宫颈癌细胞能表达VEGF2C和VEGF2D,而且瘤周间质TAM也能表达VEGF2C、VEGF2D及其受体VEGFR23;外周血中的VEGFR23 +单核细胞受到宫颈癌细胞表达的VEGF2C及其他炎性因子的趋化,进入间质后转化成巨噬细胞,表达VEGF2C、VEGF2D和VEG2FR23,导致瘤周淋巴管生成,进而导致转移的发生。Bjorn2dahl等 28 发现,在VEGF2A过表达的小鼠T241纤维肉瘤中,VEGF2A刺激了瘤周淋巴管生成并导致肿瘤发生淋巴系
21、统转移,而其间质中有大量的炎症细胞(包括表达VEFR21 +巨噬细胞)浸润。在恶性黑色素瘤中, Skobe等 29 发现,外源性的VEGF2C不仅可以诱导淋巴管生成和血管生成,还可以募集巨噬细胞。国内冯红超等 30 发现口腔鳞癌中不仅肿瘤细胞而且巨噬细胞均可分泌VEGF2C,后者在瘤周淋巴管生成和淋巴结转移中起重要作用。5 TAM有望成为肿瘤治疗的新靶点作为肿瘤间质中的一群重要细胞, TAM在肿瘤生长和进展过程中具有不可轻视的作用。因此, TAM有望成为肿瘤治疗的新靶点。主要策略如下 5, 31 : ( 1)阻断缺氧诱导转录因子( hypoxia inducible transcription
22、 factor, H IF ) 21 /CXCR4 通路。因为TAM“喜好”低氧环境,而且H IF21可诱导CXCL l2和CXCR4表达上调。( 2)利用TAM作为转基因表达的载体。通过TAM传递IFN2基因或“自杀”基因等,在低氧条件下诱导表达从而杀伤肿瘤细胞。(3)选择趋化因子作为治疗的分子靶点。例如靶向在单核细胞迁移到肿瘤低氧环境中起重要作用的CCL2、VEGF和CSF21等等。(4)人工合成小分子药物。如特异性作用于单核/巨噬细胞的抗炎药物Yondelis和贝伐单抗( bevacizumab) 、巨噬细胞毒性药物二氧化硅或抗血管生成药物利诺胺( linomide) 等等。( 5 )恢
23、复NF2kB的功能。因为NF2B 是大多数Thl型细胞因子表达所需的转录因子,而TAM表现出NF2B功能缺陷。(6)逆转TAM的活化表型。已有报道显示,使用刺激性的CpGDNA和抗IL210受体抗体处理荷瘤小鼠可以实现M2到M1的转变,从而恢复巨噬细胞的免疫活性和细胞毒作用 32 。(7)靶向效应分子。如可以选用COX22选择性抑制剂如西乐葆,诱生型一氧化氮合酶( inducible nitric oxide synthase, iNOS)选择性抑制剂如阿斯匹林, 或者IDO 选择性抑制剂MTH2trp等等。6 小 结近年研究证实,肿瘤微环境中的大量TAM在肿瘤的发生、生长、侵袭和转移过程中扮
24、演着十分重要的角色。肿瘤为逃避巨噬细胞的杀伤作用而迫使其活化表型发生改变,从而向着有利于肿瘤发展的方向演变。在此过程中,巨噬细胞已经不是机体防御的效应细胞,反过来,它们表达炎症因子、趋化因子、促血管生长因子和促淋巴管生长因子等等。然而, TAM具体是如何形成的, TAM是否就是aaMphi, TAM的表型变化是如何调控的, TAM如何发挥促肿瘤发生、生长、侵袭和转移的作用, TAM如何导致免疫抑制,肿瘤细胞和TAM之间的生物学行为关系如何等问题目前仍未解决。相信随着基因组学和蛋白质组学研究的逐步深入,以及目前可利用的差异性表达技术,我们可以实现对肿瘤间质细胞(包括TAM)基因型和表型的鉴定,并
25、跟踪TAM在肿瘤发生、生长、侵袭和转移过程中多种基因表达谱的变化,从而了解TAM与肿瘤细胞间的相互关系,最终找到对肿瘤进行有效干预的新的治疗措施。参考文献 1 Mantovani A, Allavena P, Sica A. Tumour2associated macropha2ges as a p rototyp ic type II polarised phagocyte population: role intumour p rogression J . Eur J Cancer, 2004, 40 ( 11 ) : 1660- 1667. 2 Nesbit M, Schaider H,
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45、,含有较多的非肿瘤细胞,包括基质细胞(成纤维细胞和内皮细胞) 和白细胞。巨噬细胞是浸润到肿瘤的白细胞的主要成分。肿瘤组织中的巨噬细胞,即肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrolohage,TAM)与肿瘤的关系以及在肿瘤中发挥的多种功能正被深入的研究。肿瘤相关巨噬细胞不同的活化状态决定了其在肿瘤中是发挥抗肿瘤作用或促肿瘤作用。一方面,TAM 可以通过吞噬、杀伤肿瘤细胞以及递呈肿瘤相关抗原发挥免疫监视和抗肿瘤作用;另一方面,TAM 可以通过释放许多趋化因子和细胞因子促进肿瘤生长和血管生成,并且可以降解基质促进肿瘤侵袭和转移。 巨噬细胞至少可以被分为两种类型:M1 型,即经典
46、活化的巨噬细胞 (Classically activated macrophage)和 M2 型,即替代性活化的巨噬细胞 (Alternatively activated macrophage)。M1 型巨噬细胞在细菌或其产物脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)或干扰素-(Interferon-,IFN-)的诱导下产生,表现为:高递呈抗原的能力;高分泌白细胞介素 12(Interlukin-12,IL-12)和白细胞介素 23(Interlukin-23,IL-23)及其随后诱导的型免疫应答;高产生毒性中间产物一氧化氮(Nitric oxide,NO),活性氧中间产物(Re
47、active oxygenintermediates,ROI)的能力。因此,M1 型巨噬细胞被认为具有杀伤细菌和肿瘤细胞并可以分泌多种促炎性细胞因子的能力。而 M2 型巨噬细胞可由白细胞介素 4(Interlukin-4,IL-4)、白细胞介素 13(Interlukin-13,IL-13)、糖皮质激素、转化生长因子 -(Transformating growth factor-,TGF-)和前列腺素 E2(Prostaglandin E2,PGE2)等诱导产生,表现为:低的递呈抗原的能力;产生抑制细胞增殖和活性的细胞因子,如白细胞介素 10(Interlukin-10,IL-10);较好的清
48、除碎片的能力;促进血管生成和创伤愈合的能力。 近几年来越来越多的研究表明 TAM 并未发挥抗肿瘤作用,而是参与了肿瘤的发生、生长、侵袭和转移的过程,尤其是与肿瘤的血管生成和淋巴管生成密切相关。根据巨噬细胞在肿瘤中发挥的作用及巨噬细胞的活化类型,我们推测在肿瘤中存在着这两种类型的巨噬细胞,并且肿瘤发生发展的早期,肿瘤中的巨噬细胞以 M1 型为主,发挥免疫监视和抗肿瘤作用,而在肿瘤的晚期,肿瘤中的巨噬细胞以 M2 型为主,发挥促进肿瘤生长、侵袭和转移的作用;肿瘤中巨噬细胞在肿瘤早期和肿瘤晚期发生了类型的改变,从而影响肿瘤的生长、侵袭和转移。那么,肿瘤中巨噬细胞的类型在肿瘤发生发展中是否如我们所推测
49、得这样发生类型的转换呢?不同类型的巨噬细胞如何影响肿瘤的生长?为了解决上述问题,我们使用 4T1 荷瘤 BALB/c 小鼠作为实验动物模型,观察荷瘤小鼠肿瘤早期和晚期 TAM 的类型变化。在此基础上我们研究不同类型的巨噬细胞对肿瘤生长的影响及其机制,以期为以 TAM 为靶点的肿瘤治疗提供理论基础和实验依据,对深入研究肿瘤免疫和肿瘤治疗有一定的意义。 1.巨噬细胞的分型及其鉴定 我们首先使用来源于 Abelson 小鼠白血病病毒(Abelson murine leukemiavirus)诱导的肿瘤的巨噬细胞系 RAW264.7 细胞作为体外来源的巨噬细胞。根据已有的文献 ,我们选用了 LPS作为了 M1 型巨
