1、基因工程,专题1,基因工程的概念,1、原理：,2、操作水平：,3、又称：,4、优点：,基因重组（体外）,DNA分子水平,DNA重组技术或基因拼接技术, 定向改造生物性状 （即：目的性强）, 克服远缘杂交不亲和的障碍, 育种周期短,一、基因工程诞生的理论基础 1基因拼接的理论基础 (1)DNA是生物的主要遗传物质。 (2)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。 (3)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。,2外源基因在受体内表达的理论基础 (1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。 (2)遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流动方向。 (3)生物界共用一套遗传密码。,基因工程培育抗虫棉
2、的简要过程：,二、DNA重组技术的基本工具,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,在以上过程中关键步骤或难点是什么？,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,通过运载体导入,转基因棉花含抗虫基因,转基因棉花产生伴胞晶体,转基因棉花有抗虫特性,“分子手术刀” 限制性核酸内切酶,“分子缝合针” DNA连接酶,“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体,（一）“分子手术刀”限制性核酸内切酶,1、来源：,主要来自原核生物,2、特点：,具有专一性（特异性）,(1)识别双链DNA中特定核苷酸序列,(2)切割特定序列中的特定位点,3、作用：,特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷 酸二酯键断开,4、结果：,
3、产生黏性末端或平末端,T,磷酸二酯键,A,限制酶的识别序列6、4、5、8：,回文序列、起名,EcoR,黏性末端,黏性末端,1.什么叫黏性末端？ 2.一个切口几个黏性末端？,Sma,平末端 平末端,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶 切几个切口？可产生几个黏
4、性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来 切割，会怎样？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,不同的限制酶也可以产生相同的黏性或平末端,“分子手术刀”限制酶,“分子手术刀”限制酶,(二)“分子缝合针”DNA连接酶,缝合双链DNA,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,EcoR,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,G AATTC CTTAA G,G AATTC CTTAA G,酶切,DNA连接酶的类型：,EcoliDNA
5、连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复 磷酸 二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,（三）“分子运输车”运载体或载体,2、种类：,1、需要具备的条件：,（1）在受体细胞中稳定存在，能自我复制 （2）有一个或多个限制酶切割位点,而且每种限制酶的切点最好只有一个 （3）有标记基因，便于筛选 （4）对受体细胞无害,质粒：（最常用、存于和数量？其存在与否对宿主细胞的生存没有决定性的作用，但是质粒的复制只能在宿主细胞内完成） 噬菌体衍生物、动植物病毒等,作为运载工具，将目的基因转移到受体细胞内 利用它在受体
6、细胞内对目的基因进行大量复制一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。,3、作用：,最常用的质粒大肠杆菌的质粒,试分析其作为载体的优点？,重组有三种结果,如何选择重组DNA,1、关于限制酶的说法中，正确的是（ ）A限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列 BEcoRI切割的是GA之间的氢键 C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA D限制酶只存在于原核生物中,课堂反馈,C,2.（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ）A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种 B、重组DNA的形成在细胞内完成 C、
7、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体,B、D,1.2基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,一 目的基因的获取,IMN,(一)目的基因：,编码蛋白质的基因,(二)获取目的基因的常用方法,从基因文库中获取目的基因,人工合成法（DNA合成仪）,利用PCR技术扩增目的基因,1. 从基因文库中获取目的基因,(1)基因文库的概念,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入 受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种 生物的不同的基因,称为基因文库。,(2)基因文库的类型,基因组文库和部分基因文库如cDNA文库,(3)基
8、因文库的构建,原核细胞的基因结构,IMN,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,编码区,非编码区,编码蛋白质 ,连续不间断,不编码蛋白质，有调控作用,编码序列和非编码序列,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,不编码蛋白质，有调控作用,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,外显子,内含子,与RNA聚合酶 结合位点,IMN,编码序列和非编码序列,基因组文库和cDNA文库的区别(P10),如何从基因文库获得目的基因(P9),关于内含子和外显子的说法正确的是
9、（ ）A.内含子和外显子在转录的过程中都能够转录成成熟的mRNA B.只有外显子能够转录成mRNA，tRNA，rRNA C.原核细胞基因中也有内含子和外显子 D.由于内含子不能编码蛋白质，故它属于非编码区,知识拓展,B,IMN,(1) PCR聚合酶链式反应（1988 穆里斯）,是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成 技术。通过此技术，可在短时间内获取大量的 目的基因。,2. 利用PCR技术扩增目的基因(PCR扩增仪),模板DNA；合成引物； 四种脱氧核苷酸；DNA聚合酶Taq酶。,(2)原理：,DNA双链复制,(3)前提：,一段已知目的基因的核苷酸序列,(4)条件：,(5) 过程：,变性、
10、退火、延伸三步曲,(6)结果：,以指数形式扩增（2n）,变性,1.目的基因DNA受热变性，解链； 2.引物与单链互补结合； 3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。,变性,退火,延伸,3. 通过DNA合成仪用化学的方法直接人工合成,若基因_，核苷酸序列_ 。,较小,已知,1.作用,二 基因表达载体的构建核心,IMN,2.组成,基因表达载体的构建不可能是千篇一律的,使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,同时使目的基因能表达并发挥作用,目的基因,启动子,终止子,标记基因,三 将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,动物细胞、植物细胞、微生物细胞如大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。,将目的基
11、因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化的定义：,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法, 感受态细胞吸收DNA分子,三 将目的基因导入受体细胞,1.将目的基因导入植物细胞,1）农杆菌转化法,特点:,过程：,植物组培,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,提纯含目的基 因表达载体,取受精卵,显微注射,培养成早期胚胎,发育成新性状动物,2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术,1
12、）细胞类型：,2）操作程序:,移植到子宫或输卵管,受精卵,3.将目的基因导入微生物细胞,3）常用法：,2）常用菌：,1）微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,4）过程：,大肠杆菌,Ca2+处理,Ca2+处理 大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？,四 目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定,四 目的基因的检测与鉴定,检测,个体生物学水平鉴定：,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,DNA-mRAN分子杂交,抗原-抗体杂交,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目 的基因或目的基因已经转录。,(2) 动植物细胞 除去内含子,
