1、第八章 药品生物检定技术简介药品生物检定技术：是指利用生物体（微 生物、细胞、离体组织或动物）对药物的特 定药理、毒理作用，用来测定生物药品的效 价、检查药品中的有害物质以及对制剂进行 微生物限度或无菌检查的技术方法。,第一节 无菌检查,无菌技术指在整个微生物检验过程中，控制微生物污染的一系列操作方法和措施 。,包括,紫外可见分光光度法,无菌实验器材,无菌环境,无菌操作,1、无菌环境,（1）定义 用各种方法控制实验空间内微生物数量，使其达到无菌要求。,（2）,2、无菌实验器材,包括,灭菌器材,消毒器材,玻璃器皿、接种针、注射器、试管、培养基等,凳子。试管架、天平、工作台、容器、工作人员手等,一
2、、概述 1、概念 指检查药典要求无菌药品、医疗器具、原料、辅料、及其它品种是否无菌的一种方法。,2、检查意义 是药品安全性检查项目之一 ，保证人民用药安全,无菌检查,包括,紫外可见分光光度法,烧伤或严重创伤的软膏剂与乳膏剂,植入剂,注射剂,眼用制剂,烧伤或创伤气雾剂、喷雾剂、散剂,3、范围,不得检出细菌、放线菌、霉菌及酵母菌等活菌。,包括,需氧菌、厌氧菌培养基（硫乙醇酸盐培养基）,选择性培养基,一、检查前的准备工作,（一）培养基,真菌培养基,（一）相关规定,1.检验数量 一次试验所用供试品最小包装容器的数量 2。检验量 一次检验所用供试品总量,三、供试品的检查,3、阳性对照,目的：是检查阳性菌
3、在加入供试品的培养基中能否生长,以验证供试品有无抑菌活性物质和试验条件是否符合要求。,4、阴性对照 不得有菌生长,包括,直接接种法,薄膜过滤法,（二）检查方法,（一）直接接种法 1、 供试品制备,液体试样,固体试样,青霉素类药,放射性药试样,2、检查操作 取供试品接种需氧菌、厌氧菌培养基6管 阳性对照：金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml,另供试品接种真菌培养基5管,3035,2025,培养7天,观察记录：是否有菌生长 阳性对照管在24小时內应有菌生长,（二）薄膜过滤法 1、 滤器准备,全封闭过滤系统,开放式薄膜过滤器,2、过滤操作 有抗菌供试品0.9NaCl 薄膜过滤 无抗菌供试品薄膜过滤,阳性对
4、照管： 细菌：3035培养2448h 真菌：2025培养2472h,有菌生长,四、无菌检查结果判定,1、若供试品均澄清或虽显混浊，但经证明无菌生长,阳性对照管显混浊有菌生长，阴性对照管澄清,符合规定,2. 如供试品中任何1管显混浊并确证有菌生长,不符合规定,第二节 药品的微生物限度检查,一、概述1、定义 系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法。,2、检查意义 是保证药品有效性、安全性，保证药品质量的重要错施。,3、范围 包括常用口服制剂与一般外用制剂及其原、辅料。,4、检查内容 （1）染菌量检查:细菌数、霉菌数及酵母菌数测 定 （2） 控制菌检查：大肠杆菌、沙门菌、金黄
5、色 葡萄球菌及铜绿假单胞菌,5、限度标准 不得捡出控制菌,5、试验前的准备,1. 开启紫光灯和空气过滤装置，至少 30min。检查环境洁净度10000级下的局部 洁净度100级的单向流空气区域进行。2. 人员穿戴无菌服，进入无菌操作室。4. 操作前乙醇棉球消毒启封检查瓶盖、瓶口有 无生霉、长螨,二、供试液制备,1、取样 随机抽样，一般为检验量的3倍量。 每批供试品检验量一般为10g或10ml,2、方法 ：稀释处理,三、检查法,1、细菌、霉菌及酵母菌计数 通常以每g或每ml供试药品作为计量单位,计数方法 ：平皿菌落计数法 取系列稀释的供试品接种在适宜的琼脂平板培养基上，以适宜的温度进行培养，观察
6、肉眼可见的细菌霉菌及酵母菌菌落数,2、控制菌检查,（1）大肠杆菌检查 药品中检出大肠杆菌表明该药受粪便污染，服用后有可能被肠道致病菌或寄生虫卵等病原体感染 原理 利用目标菌所共有的限定酶作用底物产生的分解产物具有颜色或荧光，以此作为指示系统来鉴定目标菌,366nm紫外线下观察,左:供试品管 中:阳性对照管 右:MUG培养基本底对照管,3、结果判断,（2）铜绿假单胞菌检查（绿脓杆菌）常见化脓性感染菌，可造成眼角膜溃疡、失 明，引起败血症等严重疾患,检验程序 增菌分离纯培养革兰染色镜检生化实验,（3）金黄色葡萄球菌检查（绿脓杆菌） 致病力最强，能引起局部及全身化脓性炎症， 严重时可导致败血症,验证
7、：计数方法的验证当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细 菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用 的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测 定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检 验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母 菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌 的回收率应逐一进行验证。,菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代 （从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代） ，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的 生物学特性。验证方法 验证试验至少应进行3次独立的平行试 验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 验 证试验也可与供试
8、品的细菌、霉菌及酵母菌计数同 时进行。,包括平皿法和薄膜过滤法。 （一）细菌、霉菌及酵母菌计数 目的：检测药物在单位质量或体积内所存在 的活菌数量，常用平皿法。验证：验证试验至少应进行3次独立的平行 试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收 率。,（1）试验组 平皿法计数时，取试验可能用 的最低稀释级供试液1ml 和50100cfu试 验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养 基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿 法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定 量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤， 冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50100 cfu试验菌，过虑，按薄膜过滤法测定其菌 数。,（2）菌液组
9、测定所加的试验菌数。 （3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落 计数方法测定供试品本底菌数。 （4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳 化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加 稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受 影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试 品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含 50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落 计数方法测定其菌数。,结果判断 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照 组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液 组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若 试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试 品对照组的平均菌
10、落数的值占菌液组的平均菌落数 的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法 和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若 任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采 用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、 中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑 菌活性，并重新进行方法验证。,操作要点： 1.一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多 个菌细胞生长繁殖而成，因此供试品中所测得的菌 落数，实际为菌落形成单位数（ cfu） 2.供试品检验的全过程必须符合无菌技术要求。 3.培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌法 的要求采用验证合格的灭菌程序灭菌。 4.作供试品稀释时，每一稀释级都要
11、更换吸管。 5.细菌培养48h，真菌培养72h，计数。如菌落 极小，不易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落 数。,6.含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培 养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养 基测定酵菌数，并且合并计数。 7.若同一稀释级两个平板的菌落平均数不小于 15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。 8.使用灭菌吸管时，管尖不要接触可能污染的任 何容器或用具。 9.供试液稀释及注皿时应振摇后取均匀的供试 液，以免造成实验误差。,10.培养基的分装量不得超过容器的2/3以免灭菌时 溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成 染菌。 11.培养基配制后应在2h内灭菌，
12、避免细菌繁殖。 12.灭菌后的培养基应保存在2-25 防止被污染， 可在三周内用毕。 13.已溶化的培养基应一次用完，一般开启后不宜再 用，更不要反复加热溶化 。,14.注皿时培养基应在451，高于45时易造 成细菌受损或致死，低于45时易凝固，影响混 匀，因此使用前可用水浴保温效果较好。15.倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到 皿盖边和皿盖上，以免影响实验结果。,16.采用薄膜过滤法时，水溶性供试液过滤前先将少 量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和 过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤 效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜 表面。供试液经薄膜过滤后，若需要
13、用冲洗液冲洗滤 膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗 量及冲洗方法同方法验证试验。每片滤膜的总过滤量 不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。,17.每张滤膜取相当于1g或1ml供试品的供试液直 接过滤或加至适量稀释剂中混匀，过滤，用适宜的 冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法及冲洗量同“计数方法的 验证”，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培 养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖 琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张 滤膜，滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则 影响微生物生长。,18.菌落数在100以内时按实有数据报告。菌落 数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按 数
14、字修约规则处理。,第三节 抗生素效价的微生物测定法,抗生素微生物检定法是国际上通用 的、经典的抗生素效价测定方法。自20 世纪40年代建立至今，在各国药典中被 普遍采用。虽然伴随着HPLC等化学分析 技术的发展，一些抗生素品种的效价测 定已被化学方法所取代，但由于以下原 因：,微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素药品的抗菌活性； 多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系； 许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化学分析方法表征其活性。,所以抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要地位，且短期内化学分析法不可能取代微生物检定法。
15、,一、概述物理、化学方法：简便、快速，本身纯度 不高，采用该法会引起偏差，因此，只有在 纯度较高时才用此法。微生物法：原理和临床应用的相一致，直 接反映出抗生素的疗效，且灵敏度较高，需 用量较小，广泛应用。,1.定义抗生素效价定义,“活性”重量单位：以抗生素中所含特定的抗菌（抗肿瘤细胞、抗病毒）活性部分的重量作为效价单位。 如碱性抗生素，以纯碱的量作为有效部分的量；酸性抗生素，以纯酸的量作为有效部分的量。,在抗生素的生产、研究和应用等方面，均 以抗生素活性成分的“活性”重量计量抗生素 的效价单位，采用活性成分的“活性”重量 1g1效价单位的方法表示。 抗生素效价以“单位（u）”或“微克（g ）
16、”表示。,例：硫酸链霉素抗菌活性是以链霉素效价单位表示的，其 链霉素的效价单位是以具活性成分链霉素碱 的“活性”重量表示的，即1链霉素效价单位 1微克链霉素碱，这里是“活性微克”而不是 “重量微克”。,在制成盐类或其他衍生物后，其相应的折算效价，可以从分子量折算而得。 如：硫酸链霉素的折算效价为,重量折算单位：以特定的纯抗生素制品的 某一重量为1单位而加以折算。 如：青霉素G钠以青霉素单位也称牛津单位（Oxford unit）表示其抗菌活性，最初的定义为“1个 青霉素效价单位（u）为能在50毫升肉汤培养 基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育 的最小青霉素剂量”。,抗生素微生物检定法可分为：（
17、1）稀释法（2）比浊法（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法） 各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。,1.定义稀释法,通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的 抗生素液体培养基中的生长情况，观察含不 同浓度抗生素的液体培养基中有无细菌的生 长，从而测定抗生素最低抑菌浓度（MIC）的 方法，常用于新药研制及临床药敏试验等方 面。,1.定义比浊法,通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的 抗生素液体培养基中的生长情况，利用分光光度法 测定含不同浓度的抗生素的液体培养基的浊度，从 而衡量抗生素抑菌效力的方法，可用于抗生素药物 的含量（效价）测定。,1.定义（琼脂）扩散法,通过测定由不同浓度的抗生素溶液在含
18、有 试验菌固体培养基中的扩散，而在其表面所 产生的抑菌圈的大小，衡量抗生素抑菌效力 的方法，多用于抗生素药物的含量（效价） 测定。,抗生素微生物检定方法比较：,定义管碟法,此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对 数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而 设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作 用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大 小，计算出供试品的效价。,2.原理抑菌圈的形成,两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌的生长作用。 当培养到一定时间，琼脂培养基中的两种互动作用达到动态平衡时，琼脂培养基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素浓度高于抑菌浓度，试验菌生
19、长受到抑制，此处琼脂培养基成透明状；在抑菌圈边缘抗生素浓度恰好等于抗生素最低抑菌浓度。,2.原理量反应平行线原理,量反应平行线原理：“在属量反应的指标中，当对数剂量和反应呈直线关系，且供试品和标准品的作用性质相同时，供试品和标准品的两条对数剂量和反应关系直线相互平行”。,2.原理量反应平行线原理,在抗生素微生物检定法中，一定剂量范围 内，抗生素对数剂量与其所致抑菌圈的大小 呈直线关系。这就在理论上决定了，（活性） 成分相同的标准品与供试品在一定剂量范围 内产生的两条剂量反应直线相互平行，符合 量反应平行线原理的基本要求。,3.检定方法,分类 一剂量法（标准曲线法） 二剂量法（2 2法） 三剂量
20、法（3 3法）,二剂量法（2 2法）：用标准品、供试品各两个剂量，根据量反应平行线原理，在相同试验条件下，比较标准品和供试品二者对微生物产生的效力。二剂量法用于抗生素药品效价的常规测定；,3.1管碟法的操作步骤,3.1管碟法的操作步骤,预试验试验准备 双碟底层的制备 供试品、标准品溶液的制备菌层的制备滴加抗生素溶液双碟的培养 抑菌圈的测量结果的可靠性检验及效价测定,预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：高剂量浓度溶液所致的抑菌圈直径在1822mm。高剂量与低剂量的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。 高低剂量之比为2:1（如高、低剂量
21、所致的抑菌圈差别较小时，可用4:1的剂量比率）。,试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及 灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、 缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。,双碟底层的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固，待用。,供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计 供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供 试品、标准品相关剂量的溶液。,菌层的制备：菌层培养基：在培养 基中添加一定量的菌悬 液，振摇混匀。注意菌层 培养基温度；根据预试验 确定加入菌层培养基的菌 液量。每只双碟加入5ml菌层 培养基。注意制备菌层的速度 和平整度。,滴加抗生素溶液：,注意标准品
22、、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。每组双碟至少为8个，一般为10个。,在每个双碟的4个钢管中，对角的两个钢管分别滴加高浓度和低浓度的标准品溶液，其余两个对角位置的钢管分别滴加相应的高、低浓度的供试品溶液。,双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平叠放的双碟数以不超过三层为宜。,抑菌圈的测量：将培养好的双碟取出，打开陶瓦盖，将钢管倒入1：1000新洁尔灭溶液或其他消毒液内浸泡，检查抑菌圈是否圆整，如有破圈或不圆整圈应将碟弃去，切忌主观挑选抑菌圈和双碟，是结果造成偏离。抑菌圈测量仪的使用：每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。手工测量：游标卡尺
23、,结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。,结果计算及判断,可靠性检验 抗生素微生物检定法前提条件是：标准品S和供试品T各对数剂量与反应呈直线关系，且标准品S和供试品T的两条直线平行。 可靠性测验是利用生物统计方法验证标准品和供试品的量反应关系是否显著偏离直线、偏离平行。对在一定概率水平下不显著偏离直线、不显著偏离平行的实验结果，认为可靠，所得检定结果有意义。,重试判定 抑菌圈大小的要求 可靠性检验： 符合可靠性检验各项规定后，才能认为试验结果可靠，方可进行效价和可信限率计算。 可信限率： 供试品效价测定结果（PT）的可信限率除特殊规定外，不得大于5%。 实测效价与
24、估计效价： 试验计算所得效价应在估计效价的10%以内，即：试验所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的110%，则检验结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。 效价测定结果不符合规定时，需换人加倍复试。,三剂量法（3 3法）：用标准品、供试品各三个剂量，根据量反应平行线原理，在相同试验条件下，比较标准品和供试品二者对微生物产生的效力。 三剂量法用于抗生素药品的仲裁或标准品的标定 。,基本要点 中剂量点的抑菌圈直径应在 1518mm。 三个剂量之比为1:0.8（1.25:1）。 点样 每组双碟至少为9个，一般为15个。 在每个双碟的6个钢管中，互相间隔的3个钢管分别滴加高、中、低浓度
25、的标准品溶液，其余3个钢管内分别滴加相应的高、中、低浓度的供试品溶液。 按SHTHSMTMSLTL或THSHTMSMTLSL顺序，分别滴加标准品和供试品高、中、低剂量溶液。,三剂量法双碟、钢管与抑菌圈位置图S3：标准品高剂量 S2：标准品中剂量 S1：标准品低剂量 T3：供试品高剂量 T2：供试品中剂量 T1：供试品低剂量,抑菌圈的测量 双碟在规定温度下培养一定时间后，采用抑菌圈测量仪测量每组试验双碟抑菌圈的直径。 结果计算及可靠性检验,管碟法特点,优点： 基本操作和设计适用于各种抗生素，试验结果较稳定； 样品用量少，灵敏度高； 适合于大批样品的测定。,缺点: 凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定
26、结果； 试验过程长，需第二天才有结果； 操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的结果； 受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度。,0个（cp2000),1个（cp2005）,22个（cp2010),比浊法,浊度法：是利用抗生素在液体培养基中对试 验菌生长的抑制的作用，通过测定培养后细 菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试 验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的 一种方法。,基本原理：细菌接种于澄清的营养丰富的液体培 养基中，在一定的温度下培养一段时间，变浑浊， 其浑浊程度与细菌数的增加、细菌群体质量的增加 和细菌群体细胞容积的增大之间存在着直接的关系
27、。当一定的光束照射其已经浑浊的液体培养基时， 通过测定其透过率就知道细菌生长情况，在一定的 抗生素浓度范围内，剂量响应为一直线。因此，在 剂量响应曲线的直线范围内，可设计比浊法测定抗 生素含量。,比浊法的操作步骤：,预试验试验准备供试品、标准品溶液的制备 菌液培养基的制备加抗生素溶液 比色管的培养菌浓度的测量 结果的可靠性检验及效价测定,预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使高、低剂量浓度标准品溶液所致的菌液浓度的吸收值在0.30.7范围；高、低剂量浓度标准品溶液所致的菌液浓度的吸收值的差值大于0.1为佳。,试验准备：比色管、搅拌转子、塞子的清洗及灭菌
28、； 容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液 的准备、半无菌间的紫外消毒等。,供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供 试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试 品、标准品相关剂量的溶液。,菌液培养基的制备：根据预试验确定加入液体培养基的菌液 量，注意制备菌液与培养基充分混匀。 加抗生素溶液：在比色管中定量加入抗生素溶液后，再定 量加入菌液培养基，混匀后，在规定温度培 养.,菌浓度的测量：在530nm或其他波长(580nm)处测定各比色管的菌液浓度，注意测定时间的一致性。 结果的可靠性检验及效价结果,注意事项：,加菌量的影响：加菌量的多少（0.25%、 0.5%、1.0%），
29、影响培养至适宜的菌液测定 浓度所用的时间，加菌量过少，则测定时可 利用的浓度范围窄。 各抗生素各浓度之间的吸收度的差值在0.1 以上为佳，此时菌液对不同浓度的抗生素敏 感，测定误差较低。,比色池的清洁： 测定用的比色管需用硝酸 硫酸（5：95）浸泡并用蒸馏水冲洗干净， 不要有污渍和划痕，与分光光度计的试管要 匹配，要清除抗生素残留和清洗液的痕迹， 除去纤维等杂质。,时间的一致性：主要是使每管的培养时间相等， 实验时在试管中加入含试验菌液的培养基后，应立 即加入标准品溶液和供试品溶液，混合均匀。必要 时可先将培养基冷却至24左右，再接种菌种， 并在此温度下，将含菌培养基加至各试管中，可避 免加注
30、试管先后的误差。培养终止时将各管同时放 入冰浴中，并尽快加入甲醛溶液灭活，使各试验管 的培养时间一致。,培养温度控制：温度的均匀性直接影响试验菌的生长速率。美国药典28 版中对管碟法的培养温度要求为0.5，而比浊法的温 度要求0.1，更为严格。 一般恒温水浴的各部位仍有差异，应有搅拌装置，使 培养温度均匀。 培养管的材质和管壁的厚度及体积大小应均匀一致， 若厚薄不均可能影响温度的传导，使培养温度不均一。 在水浴中供试品溶液和标准品溶液的放置位置最好按 随机区组分配，以抵消温度的差异。,菌液需新鲜配制：当天使用，若放在冰箱放置一段时间后再 使用，所测定的数据不稳定，误差大（金 葡）。因为菌液在放
31、置一段时间后，细菌老 化死亡，但测定的吸收值不变，从而影响试 验时活菌的量，使结果产出偏差。注意菌种使用不超过5代。,比浊法的特点：,优点： 与管碟法比较，比浊法具有快速，试验过程34小时，加上其他操作，可在当天获得结果； 采用液体培养基，无扩散因素的影响，试验的灵敏度高，结果的精密度和正确度都较琼脂扩散法好。,缺点： 对试验仪器的性能及试验器具的要求较高，如培养温度要求一致，比色管的清洁等。 任何影响液体培养基内微生物生长的因素都会影响抗生素效价的测定。,第四节 生化药物效价的生物测定法 防病治病的三大药源：化学药物生化药物生物药物 生物技术药物生物制品中药,生物药物：利用生物体、生物组织或
32、器官等成分， 综合运用生物学、生物化学、微生物学、免 疫学、物理化学和药学的原理和方法制备的 一大类药物。 包括：生化药物、生物合成药物、生物制 品。,生化药物：动植物及微生物提取、分离的天 然生物活性物质及半合成得到生命基本物质 及其衍生物等。应用前景：方便临床应用；弥补某些药物的 市场空缺；有利于临床治疗；有利于人体健 康，前景非常广阔。,种类：1.氨基酸、多肽与蛋白质类；2.药用酶类和辅酶类；3.多糖类；4.脂质类；5.核酸及其降解物和衍生物类药物。,常见的生化药物：复合氨基酸、脑多肽、牛纤维蛋白原、水 蛭素、生长素、催乳素、天花粉蛋白、辅酶 Q10、蛋白水解酶、凝血酶、肝素、硫酸软 骨
33、素A、灵芝多糖、透明质酸、黄芪多糖、 人参多糖、胆酸类、RNA、DNA、ATP、 5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖腺苷、环胞 苷等。,生化药物的特点： 1.分子量大，不是定值。肝素（抗凝血）1200015000（未分 级） 低分子肝素（抗血栓）8000（低分子 量） 右旋糖苷70 6400076000不定值,2.结构确认难，需采用生化法确认（氨基酸 序列分析、肽图） 例：重组人粒细胞刺激因子注射液（ChP） 原液检定： 肽图：至少每半年检定一次 N-末端氨基酸序列：至少每年检定一次,3.需检查生物活性 例：细胞色素C溶液 【检查】活力 照细胞色素C活力测定法测 定，不得低于95.0%。 尿激酶
34、 【检查】凝血质样活性物质 凝血质样活性 为零值时的供试品酶活力，按每1ml中供试 品的单位表示，每1ml应大于150单位。,4.要求检查安全性 5.需做效价的测定 例：肝素钠 【效价测定】照肝素生物测定法测定，应符 合规定，测得的结果应为标示量的91.0%110.0% 检定用的生物体：新鲜兔血或兔、猪血浆。,第五节 安全性检查,杂质来源：原料药（包括制备中间体、副反应产物等）辅料及试剂生产工艺降解产物 杂质特点：化学结构不清楚 没有合适的理化检测方法 对生物体可产生特殊的生理作用影响到用药的安全,一、安全性检查项目 包括： 细菌内毒素检查 热原检查 异常毒性检查 升压与降压物质检查 过敏反应
35、检查 溶血与凝聚试验 目的：控制药品中存在的、可对生物体产生特殊的生理作用并影响到用药安全的某些痕量杂质。,异常毒性检查,一、方法系将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内或口 服给药, 在规定的时间内观察小鼠出现的死亡情况, 以判定供试品是否符合规定的一种方法。异常毒性是检查药品在生产制造过程中外来引 入的异物或药物降解产生的不正常毒性反应，主要 与生产工艺水平有关，而不是检查药物本身毒性。,二、适用品种 生化药注射剂(如肽、蛋白质、酶及辅酶、多糖、脂质等)及抗生素类注射剂； 某些中药注射剂； 在药品生产工艺进行较大改变后，特别是改变提炼、精制工艺时，需要在生产过程中追踪检查各工艺段的半成品及成品
36、的毒性试验。,三、相关进展 目前异常毒性检查法仅中国药典和英国药典有收载； 国外药典中，对大多数生物提取的生化药或由现代生物技术得到的组份单一、结构明确的产品,一般不设定异常毒性检查项； WHO 生物测定专家委员会在1997年曾开会讨论异常毒性检查的必要性问题，认为其缺乏专属性和科学性，在实施GMP条件下生产的药品应当取消该项检查。,供试用的小鼠应健康合格，体重1720g在试 验前及试验的观察期内，均应按正常饲养。做过本 试验的小鼠不得重复使用。 供试品溶液的制备 除另有规定外，用氯化钠注 射液按个品种项下规定的浓度制成供试品溶液。检查法 除另有规定外，取小鼠5只，按各该药品 项下规定的给药途
37、径，每只小鼠分别给予供试品 0.5ml。给药途径有以下几种：静脉注射 将供试品溶液注入小鼠尾静脉， 应在45秒内匀速注射完毕。规定缓慢注射品种可 延长至30秒。,腹腔注射 将供试品溶液注入小鼠腹腔。皮下注射 将供试品溶液注入小鼠腹部或背部两 侧皮下。口服给药 将供试品溶液通过适宜的导管，灌入 小鼠胃中。结果判断 除另有规定外，5只小鼠在给药后48h 内不得死亡。如有死亡，应另取体重1819g小鼠10 只复试，全部小鼠在48小时内不得有死亡。,细菌内毒素检查,一、方法：系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生 的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量 是否符合规定的一种方法。在GMP条件下，
38、无内毒素即无热原，控制内毒素 就是控制热原，这是用细菌内毒素检查法代替热原 检查法的依据。,二、适用品种：制剂：静脉注射、鞘内注射原料：无菌分装原料静脉注射用的抗生素类原料不可灭菌制剂的原料（如生化药品、生物制品）制备分装过程无法控制内毒素的注射剂的原料,因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。如 自来水中含内毒素的量为1至100EU/ml。当内毒素通 过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过 注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒 素小量入血后被肝脏枯细胞灭活，不造成机体损害。 内毒素大量进入血液就会引起发热反应“热原反 应”。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、 放射性药物、抗
39、生素类、疫苗类、透析液等制剂以 及医疗器材类（如一次性注射器，植入性生物材料） 必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。,2005年版中国药典规定168个品种进行 细菌内毒素检查法，并收录了2种细菌内毒 素检查法：包括凝胶法和光度测定法两种方 法。凝胶法利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集 反应的原理来定性检测或半定量内毒素。,光度测定法包括浊度法和显色基质（比色） 法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中 的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放 出呈色团的多少来定量测定内毒素。比色法 又可分为终点显色法和动态比色法。检查时，可使用任何一种方法进行试 验，当测定结果有争议时，一般以凝胶法结 果为准。
40、,热原检查,一、方法系将一定剂量的供试品溶液, 静脉注射家兔体 内, 在规定的时间内, 观察家兔体温升高的情况, 以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。热原检查是一种限度试验，反映了热原质引起 哺乳动物复杂的升温反应过程，具有直观、代表性 好的优点，是一种成熟方法，各国药典均有收载。,二、适用品种主要用于生物制品、抗生素、生化药品 类注射剂及在生产过程中容易被微生物污染或适宜微 生物繁殖化学药品的注射剂；做静脉注射的注射液，尤其是剂量较大的静脉 滴注药，更要注意热原检查。某些抗生素、抗肿瘤药品、放射性药品等影 响家兔正常体温, 因此不适宜采用热原检查法。目前存在着细菌内毒素检查逐步替代热原
41、检 查的趋势。,三、热原检查热原通常是磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合 物。磷脂多醇是复合物的活性中心，致热作用最 强。是能够致热的微生物的尸体及其代谢产物，即 细菌的一种内毒素。细菌、霉菌、病毒均可产生热 原。热原最主要特性为耐热性，其为由磷脂、脂多 糖和蛋白质所组成的复合物，存在于细菌的细胞和 固体膜之间。,脂多糖是内毒素的主要成分，具很强的热原 活性。热原具耐热性、滤过性、水溶性、不 挥发性、被吸附性。当热原被输入人体后， 约0.5h后，使人发冷寒战、高热、出汗、恶 心、呕吐、昏迷甚至危及生命，可于注射剂 灭菌时根据其特性彻底破坏热原。,注入人体的注射剂中含有热原量达 1g/kg就可引起不
42、良反应，发热反应通常 在注入1小时后出现，可使人体产生发冷、寒 颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时 体温可升至40以上，严重者甚至昏迷、虚 脱，如不及时抢救，可危及生命。该现象称 为“热原反应”。,中国药典2005年版规定热原检查采用家兔 法 ，由于家兔对热原的反应与人基本相似，所以用 家兔来检测热原，为保障药品质量和用药安全发挥 了重要作用。本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体 内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以 判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。,供试用的家兔应健康无伤，体重1.73.0kg， 雌兔应无孕。预测体温前7日即应用同一饲料饲养, 在此期间内，体重应不减轻
43、，精神、食欲、排泄等 不得有异常现象。每一家兔的使用次数，用于一般 药品的检查，不应超过10次。,试验前的准备 在作热原检查前12日，供试用家 兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养 室的温度相差不得大于5，实验室的温度应在 1725,在试验全部过程中，应注意室温变化不 得大于3，防止动物骚动并避免噪音干扰。家兔 在试验前至少1小时开始停止给食并置于适宜的装 置中，直至试验完毕。 试验用的注射器、针头及一切和供试品溶液接触 的器皿,应置烘箱中用250加热30分钟，也可用 其他适宜的方法除去热原。,取适用的家兔3只,测定其正常体温后15分钟以 内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38的
44、供试品溶液，然后每隔30分钟测量其体温1次,共测 6次,以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为 该兔体温的升高温度（）。如3只家兔中有1只体 温升高0.6或0.6以上,或3只家兔体温升高均 低于0.6,但体温升高的总和达1.4或1.4以 上，应另取5只家兔复试，检查方法同上。,结果判断 在初试3只家兔中，体温升高均低于0.6 ，并且3只家兔体温升高总和低于1.4；或在复 试的5只家兔中，体温升高0.6或0.6以上的家 兔不超过1只,并且初试、复试合并8只家兔的体温 升高总和为3.5或3.5以下,均判为供试品的热 原检查符合规定。,在初试3只家兔中,体温升高0.6或0.6以上 的家兔超过1只；
45、或在复试的5只家兔中，体温升高 0.6或0.6以上的家兔超过1只；或在初试、复 试合并8只家兔的体温升高总和超过3.5，均认为 供试品的热原检查不符合规定。,升压及降压物质检查,一、方法升压物质检查是比较垂体后叶标准与供试品升高 大鼠血压的程度，以判定供试品中所含升压物质的 限度是否符合规定的方法。降压物质检查系比较组胺对照品与供试品引起 麻醉猫血压下降的程度，以判定供试品中所含降压 物质的限度是否符合规定。,二、适用品种 有可能产生类组织胺样急性降血压反应的静脉注射剂，如生化药注射剂(肽、蛋白质、酶及辅酶、多糖、脂质等)及抗生素注射剂； 在用动物脏器或组织为原料制备生化药物的过程中，正常组织
46、内存在的组胺及部分氨基酸脱羧形成的组胺、酪胺等胺类物质，均为这类杂质的来源。,过敏反应检查,一、方法系将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内, 间隔 一定时间后静脉注射供试品进行攻击，观察动物出 现过敏反应的情况，以判定供试品是否引起动物全 身过敏反应。过敏反应检查是观察动物接触受试物后所产生的全 身性反应，一般是指型又称速发过敏性反应 。,二、适用品种 有可能含有异性蛋白（如原料药来源于动物组织、天然提取或发酵药物），或在临床应用中曾出现过敏反应的注射剂； 过敏试验是检查异性蛋白的试验。药物中若夹杂有异性蛋白，在临床使用时易引起病人多种过敏反应，如皮肤红斑或丘疹，窒息、血管神经性水肿、血压下降，甚
47、至休克和死亡。,剂量设置应首先观测供试品对豚鼠腹腔注射（或皮下 注射）和静脉给药急性毒性反应，根据豚鼠毒性反应剂 量和临床使用剂量来确定豚鼠致敏剂量和攻击剂量； 一般致敏以腹腔注射为主，攻击以静脉注射为主，攻 击剂量应大于致敏剂量，两种剂量均应小于急性毒性最 小反应剂量； 一般致敏剂量应为人临床剂量（按公斤体重计）的10 倍以上，攻击剂量应在20倍以上，但应不出现急性毒性 反应。,首先进行预试验，应取至少9只豚鼠，分3组，三次致敏后，在首次致敏日后14日、21日、28日进行攻击以确定攻击最佳反应时间； 必要时，预试验采用半成品进行致敏和攻击研究，以确定该注射剂成分和工艺有无致敏的可能性； 取至少三批样品进行验证。,因为试验周期长，环境因素和动物质量对结果影响大，应注意采用SPF级豚鼠，在符合规定的设施条件下完成，同时设阳性对照组和空白对照组； 药物过敏反应并不都是型,还有II 型细胞毒或溶细胞型, III 型免疫复合物型或血管炎型, IV 型迟发型或结核菌素型,因此豚鼠过敏反应检查有一定局限性。 尽管豚鼠是进行过敏反应检查最敏感动物，但因与人类存在较大的种属差异，存在着过敏反应的高阴性率与临床反应的高阳性率的差异，即相关性较差，并不能完全反映人的情况。,
