1、多肽及蛋白质药物的脑转运,汇报人：高磊 主管药师 304医院药剂药理科制剂室, Peptide and proteinTreatment of CNS diseases, 治疗中枢神经疾病的肽类及蛋白质药物,Ischemia,Inflammatory CNS diseases 中枢炎症性疾病,Neurodegenerative diseases（epilepsy, Alzheimers disease, Parkinsons disease ）,Acute and chronic pain 急性或慢性疼痛,Peptides and Protein drugs P/P drugs,Emotion
2、al diseases （depression et al）情感障碍（抑郁等）,局部缺血,神经退化性疾病，如帕金森、阿默症、癫痫等,P/P种类,中枢疾病应用举例,寡肽,多肽,蛋白质,di- /tri-peptides,肌肽 促甲状腺素释放激素TRH,octa- /nona-peptides,抗利尿激素 催产素 血管紧张素,成纤维细胞生长因子-2,Vasoactive Intestinal Peptide,insulin,生长激素抑制素,GnRH促性腺激素释放素,脑部肿瘤、促性成熟,Vasopressin加压素,调节记忆,Melanotropin促黑激素,抗抑郁,Neurotrophins神经营
3、养因子,阿默病、帕金森等,Nerve growth factor 神经生长因子,阿默病, brain delivery barrier for P/P drugs, P/P药物脑转运障碍,一、血脑屏障 blood brain barrier, BBB,血脑屏障的发现 Discovery,19 世纪末,德国细菌学家Ehrlich 发现注入机体的染料可以将全身所有器官染色,却独独不能将大脑染色。后来他的一个学生Goldman 继续了这个实验,发现将染料注入脑髓液中,只有大脑被染色而其他器官不被染色,由此Goldman 正式提出了血脑屏障(blood brain barrier BBB) 的概念。直
4、到20 世纪60 年代,电子显微镜的研究才揭示了血脑屏障的解剖学基础。,是血液与脑组织间的一种特殊屏障，它主要 由脑毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接,毛细血管基底膜及嵌入其中的周细胞和星形胶质细胞终足形成的胶质膜。,血脑屏障结构剖析 Anatomic structure,内皮细胞 (Endothelial cell，EC),脑血管EC 与其他组织EC 的主要区别在于前者具有复杂的紧密连接和丰富的线粒体, 但缺少跨膜转运的质膜小泡(plasma vesicle) 以及缺乏细胞孔。另外, 脑血管细胞内皮细胞的胞膜上含有一些特殊蛋白: 碱性磷酸酶、r - 谷氨酸转肽酶、糖转蛋白、转铁蛋白受体等。以上
5、结构是脑血管内皮细胞特有的, 它们对维持脑血管内皮TJ 功能具有重要作用。,主要由 1.跨膜蛋白(claudins, occludin, and junction adhesion molecule) 2.胞质附着蛋白（ TJ 支持结构的基础） 3.细胞骨架蛋白(维持TJ 的稳定),紧密连接（Tight junction）,脑血管的超微结构研究表明, 星形胶质细胞环脑血管现象，是脑血管的一个独有的特点。大量事实表明:星形角质细胞对BBB的分化与维持有着重要的作用。,星形胶质细胞 Astrocyte cells,基膜 基膜主要由IV 型胶原、层连蛋白内肌动蛋白、纤维连接蛋白以及一些糖蛋白等组成,
6、研究发现, IV 型胶原可以直接与层连蛋白, 也可以通过内肌动蛋白与层连蛋白连接, 形成聚合体网, 同时, 纤维连接蛋白可将基膜与周围组织以及细胞外间质相连,基膜对BBB 的屏障作用维持起着重要作用。另外,基膜对周围细胞的生长分化也起着调节作用, 脑血管内皮细胞生长和分化就是星形胶质细胞通过基膜来完成的。,二、酶障碍 enzymatic barrier,这些酶本来是代谢血管产生的内源性肽物质的,Endothelial cells expressing metabolic enzyme： aminopeptidases, carboxypeptidases,三、泵出系统 Efflux syste
7、m,1.阻止某些物质（多半是有害的）由血液进入脑组织的结构 2.减少受甚至不受循环血液中有害物质的损害 3.保持脑组织内环境的基本稳定 4.维持中枢神经系统正常生理状态,BBB的作用与意义,The composition of brain extracellular fluid is controlled within a precise range, independent of fluctuations within the blood., 影响BBB通透性的因素,物质的脂溶性,物质的亲水性,与血浆蛋白的结合程度,载体运转系统,物质的分子量,脂溶性越高的溶质通过屏障进入脑组织的速度也越快,
8、巴比妥改造成苯巴比妥,吗啡改造成二乙酰吗啡,形成氢键的能力越强，水溶性也越强，通过血脑屏障的能力也越差,报道between 150 and 500 Da为合适范围,报道：分配系数 0.5 and 6.0 为合适范围,必须待药物游离以后才能通过屏障发挥其效应,特异性载体蛋白，可使一些难于通过血脑屏障的物质顺利转运迅速入脑选择性屏障,病理因素,新生儿核黄疸（胆红素脑病）和血管性脑水肿，使脑毛细血管内皮细胞间紧密连接开放，屏障的通透性显著提高以致血浆白蛋白（分子量为69000）这样的大分子物质都可通过屏障。严重脑损伤导致血脑屏障的严重破坏，使血清蛋白也可通过屏障进入脑组织。随损伤的修复，大分子物入脑
9、首先停止。完全恢复后小分子物交换加快现象也会消失，此时血脑屏障功能已经正常。电离辐射、激光和超声波都可使血脑屏障的通透性增加。 新生儿血脑屏障发育不全，通透性较高。,多肽及蛋白质药物的不利, P/P药物BBB转运方式 Transport mechanisms,A 水溶性小分子,B 脂溶性小分子，酒精，类固醇激素等,C 内源性物质，营养物质，如己糖、氨基酸、一元羧酸、神经递质、核苷、有机阴/阳离子（特异性，可饱和）,D 胰岛素、胰岛素样生长因子、转铁蛋白、血管紧张素等结合-内陷-成泡（内涵体）,溶酶体降解,受体循环利用,跨BBB释放,E 阳离子蛋白质，如精氨酸、组氨酸与卵白素、白蛋白等（与血管内
10、皮细胞阴离子区域静电结合，激发内吞）,F 相反方向（如上述泵出系统总结）,Blood to brain,Brain to blood,The iron transport protein, transferrin,is endocytosed (when bound with iron) into cerebral endothelial cells using a receptor mediated endocytosis mechanism (42). A low pH vesicle (pH 5.4) fuses with theendocytotic vesicle.At acidic
11、 pH iron has a lowaffinity to transferrin and is released into the cell, both the transferrin andtransferrin receptor are then recycled to the luminal membrane and apotransferrin is released,转运方式图示 Transport mechanisms,主动转运（可饱和转运）载体文献总结,脑部发挥作用的肽类（/药物）,Size, flexibility, conformation, biochemical pro
12、perties of amino acids, and amino acid arrangement. These factors determine the lipophilicity, hydrogen bonding potential, and molecular weight of the peptide. degree of protein binding, enzymatic stability clearance rate, and affinity for carrier mechanisms,有人主张为此类药物的生物利用度再定义：,非进入体循环的速度与程度，而是能转运至 脑
13、组织的速度与程度,影响P/P药物脑转运的因素,V 增加P/P药物脑摄入方法,一、侵入性方法 Invasive methods,原理：暂时打开Tight junction,Intracarotid administration of hypertonic solutions（mannitol，arabinose) in rats,颈动脉注射高渗溶液(如甘露醇、阿拉伯糖等），内皮细胞皱缩，紧密连接暂时打开,这类方法普遍毒性、副作用大,Ultrasound and electromagnetic radiation 超声与电磁辐射,暂时打开紧密连接,其他血管活性物质有：缓激肽， 组胺， RMP-7等
14、,基于神经外科手术的脑室内/大脑内/鞘内输注,Intracarotid administration vasoactive substance 颈动脉注射血管活性物质,leukotriene C4 打开bloodtumor barrier （BTB）而BBB不受影响（因为BBB含-谷氨酰转肽酶，而BTB中缺乏）,某些有机溶剂：乙醇、DMSO、表面活性剂如SDS、Tween80等,二、非侵入性方法 Non-invasive methods,1. 化学修饰,增加脂溶性,去掉极性基团或引入非极性基团,羟基个数增长使跨脑膜能力成指数下降，可以甲基化或成酯或酰胺,N端乙酰化，C端胺化，或加入苯丙氨酸（脂
15、溶性氨基酸）,前提构象不要变，与受体结合发挥作用的基团不要变（一、二、三级）,10倍,海洛因,enhance their lipid solubility,10倍,此种方法综合考虑：分子量 与分子大小、与血浆蛋白的 结合、与Pgp的结合、与酶 的亲和力,The enkephalin analog, DPDPE, is a cyclized peptide containing D-penicillamine (D-Pen) at positions 2 and 5,例1,Biphalin (Tyr-D-Ala-Gly-Phe)2, a unique enkephalin analog cont
16、aining two enkephalin sequences linked by a hydrazide bridge ,例2,成环 Cyclization,成环,卤化,increases the metabolic stability,卤化 Halogenation,增加脂溶性，如上表,2.前药 Prodrug,which can be enzymatically cleaved after brain delivery,利用氧化还原反应 redox system,有些在N端或C端连上苯丙氨酸，此连接物在血液中稳定，入脑后酶解断裂,将雌二醇连上甲基-二氢吡啶，此前药很快透过BBB，进入脑后
17、被NADH脱氢酶氧化为季铵盐，无法再透膜返回血液。这在药学中被称为药物在组织中的“锁定”,3.利用营养物质载体 Nutrient transporters,BBB对一些内源性物质及营养物质存在主动转运载体，有时多肽药物可以利用,左旋多巴,中性氨基酸载体 large neutral amino acid carrier.,Biphalin, 阿肽类似物，利用中性氨基酸载体入脑 use the neutral amino acid carrier system to gain entry into the brain,4. 载体底物偶联 chimeric drugs,将单抗OX26同肽类药物偶联，
18、增加后者脑摄取,将insulin同辣根过氧化物酶相连，可以增加后者的脑摄取,将肽与某个通过受体介导入脑或吸附入脑的物质偶联，带入脑，通过酶降解释放药物,注意底物带来的副作用或与底 物竞争带来底物脑摄取减少,将己糖同肽类药物偶联，增加后者脑摄取,杂合肽 在肽链中掺入碱性氨基酸，如精氨酸、赖氨酸等,5. 阳离子化 Cationization,利用absorptive-mediated endocytosis (AME)，BBB内皮细胞表面带负电荷,人白蛋白偶联，前者带正电，利用absorptive-mediated endocytosis (AME)。如将内啡肽偶联后，可以增加内啡肽的脑摄取,6.
19、 药剂学手段 Pharmaceutical approach,通过鼻腔途径给药，绕过血脑屏障，直接进入脑组织。药物从鼻腔入脑 的途径主要有：嗅神经通路、嗅黏膜上皮通路、血液循环通路,药物载体 liposomes and nanoparticles,(i)容易进行结构修饰，靶向特殊组织、器官如利用脑毛细血管内皮细胞上存在的特异性载体，如氨基酸载体、己糖载体、单羧酸载体等，在微粒表面连接相应的配体，通过抗原抗体的特异性反应，启动受体接到的胞吞转运，促进药物透过血脑屏障(ii) 保护药物不被代谢酶破坏(iii) 包裹多肽，屏蔽了其理化性质如亲水、成氢键,liposomes 包裹GABA用于治疗青霉素
20、诱发的癫痫，疗效比游离GABA好,nanoparticles,用Tween80修饰的纳米粒，可以在血浆内锚定ApoB and ApoE ，然后在载脂蛋白的介导下通过内吞途径跨过BBB,nanogel纳米凝胶,应用最多的是聚氧乙烯-聚乙烯亚胺凝胶，由于PEI（聚乙烯亚胺）有大量游离氨基，可以连接特异配体，如胰岛素和载体蛋白等。,Vinogradov 等成功应用纳米凝胶载体将寡核苷酸传递入脑,a 使用泵出系统抑制剂,b 使用酶抑制剂,c 包裹入载体中,7. 减少损失,L-DOPA与芳香族脱羧酶一起给药,附：抗生素与BBB,较易透过血脑屏障的抗生素： 哌拉西林 阿莫西林 头孢曲松钠 甲硝唑 利巴韦林 阿昔洛韦 更昔洛韦、异烟肼、 利福平、吡嗪酰胺、利福喷汀,一般不易透过血脑屏障，但能透过有炎症的血脑屏障的抗生素： 青霉素钠、氨苄西林、 舒巴坦-氨苄西林、头孢呋辛、头孢噻肟钠、头孢他啶、 头孢哌酮钠、 头孢吡肟、美罗培南、硫酸阿米卡星、克林霉素、盐酸万古霉素、 盐酸去甲万古霉素,难于透过血脑屏障的抗生素： 头孢克洛 头孢拉定 头孢唑啉 林可霉素、红霉素、亚胺培南-西司他丁钠(泰能),Thank You！,诸位多提宝贵意见！,没讲到的请大家讨论完善补充！,
