1、1,第四章 细胞培养,2,别名：紫杉（第四纪冰川遗留下来的古老树种，在地球上已有250万年的历史。）,常绿针叶，结樱桃大的奇特红豆果。全世界自然分布极少，列为国家一级重点保护植物，为珍贵的用材树种，特别由于含有抗癌特效药物紫杉醇而非常珍贵，这种神奇的药物是继阿霉素和顺铂之后，目前世界上最好的抗癌药物，是迄今国际市场最畅销，最热门的新型抗癌药物，具有极高的开发利用价值。,红豆杉,3,紫杉醇最早是从短叶红豆杉的树皮中分离出来的抗肿瘤活性成份。是治疗转移性卵巢癌和乳腺癌的最好药物之一，同时对肺癌、食道癌也有显著疗效，对肾炎及细小病毒炎症有明显抑制。紫杉醇的抗癌机理是：紫杉醇能与微量蛋白结合，并促进其
2、聚合，抑制癌细胞的有丝分裂，有效阻止癌细胞的增殖。,4,紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮、叶及茎中， 其中树皮中的含量最高，但即使现在公认含量最高的短叶红豆杉树皮中也仅有0069。 大约从12000株成年紫杉树中才能提取1KG的紫杉醇，而且紫杉的生长周期很长，在世界分布很少。,5,植物次生代谢产物,是植物的生活细胞通过次生代谢途径产生的一些天然化合物，其中许多是对人类有用的，如生物碱、色素、酶、农药，广泛应用于医药、食品、化工、能源等。,6,植物次生代谢产品的市场潜能,产品成分 用途 年销售额（亿美元） 长春花碱 治疗白血病 1820（美国）阿吗灵 循环系统障碍药 525（全世界）奎宁 治疗疟疾
3、 510（美国）致热素 杀虫剂 20（全世界）毛地黄 心脏病药 2055（美国）,7,次生代谢产物的获得途径：,1.直接从植物中提取次生代谢产物 2.化学合成 3.微生物(细菌或真菌)发酵 4.利用基因工程生产次生代谢产物 5.利用植物组织和细胞培养法生产次生代谢产物,8,1.直接从植物中提取次生代谢产物,但是，次生代谢产物在植物中含量一般较低，并且由于长期的盲目采挖，已造成了植物野生资源的严重破坏，可利用的资源数量日趋减少，一些濒危动植物的使用又受到国际自然保护组织的关注，有许多原料性植物资源目前已面临资源枯竭的威胁，因此，人工栽培就成为生产的主要方式。,9,不足,大量占用耕地，引种困难，生
4、长周期长，栽培过程中各种影响因素不易控制，有效成分含量低，品种品质不稳定，大量使用人力、物力及财力等。,10,2.化学合成,在完全了解次生代谢产物在植物体外的反应步骤后，利用化学工业，完全合成或半化学合成次生代谢产物 但是采用化学合成的方法，会遇到收率低、成本高、毒性大、工艺流程复杂、产生同分异构体及环境污染等问题。,11,3.微生物(细菌或真菌)发酵,由于微生物具有易培养、易控制、生产成本低、生长快、不受原料的限制、发酵产物较植物成分单一、有效成分易分离等优点，并可通过诱变育种等手段来提高菌种性能以及有效产物的含量，所以容易实现大规模工业生产。,12,4. 利用基因工程生产次生代谢产物,目前
5、，利用基因工程获得药用植物次生代谢产物主要有两个途径，一是利用生物反应器进行转基因植物细胞或微生物细胞进行生产次生代谢产物；二是培育转基因植株，通过人工栽培提供高含量次生代谢产物的植物。,13,5.利用植物组织和细胞培养法生产次生代谢产物,通过采用固定化植物细胞培养技术可以克服细胞大量培养的许多困难，以小规模的培养细胞大量生产胞外目的产物。植物细胞和组织培养最显著的价值在于优良植物的快速繁殖与次生代谢产物的大量制备方面。,14,日本有关组织从红豆杉中诱导产生愈伤组织，筛选得到细胞培养4周就增殖了5倍，紫杉醇的含量达到了0.05，比树皮中紫杉醇的含量高达10倍。Ketchum从6种紫杉醇属植物中
6、进行愈伤组织的诱导，获得了产生紫杉醇的高产细胞株，在悬浮培养下，细胞内的紫杉醇含量超过了20mg/L。清华大学化工系生物化工研究所通过固液两步培养法可以在4周内获得20g/L干物质，利用代谢调控技术在23天内将紫杉醇的含量提高到0.063%左右。,15,紫草宁可用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药物，同时又因为其漂亮的紫红色而作为高级色素使用。紫草宁产生于亚洲的多年生 植物紫草的根部 。但紫草资源严重不足，在日本，紫草已濒临灭绝，在我国，紫草（Arnebia euchroma)列入了国际二级保护植物,16,植物细胞间在遗传、生理和生化上存在着种种差异。尽管造成差异的原因很复杂，但是自然环境引起的突变
7、总是存在的。这种差异反映在它们的产量、品质、抗病虫性和次生代谢产物的产量和性质等方面。如果能把具有对某些物质合成能力强的细胞筛选出来，使它们增殖成细胞系。这些具有高抗、高产、高品质的突变细胞系，将会给农业生产带来很好的经济效益。不仅如此，也会给医药工业、酶工业以及天然色素工业带来天翻地覆的变化。,17,细胞培养的概念,植物细胞培养（plant cell culture）是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养，并使其增殖的技术。,第四章 植物细胞培养,18,细胞培养的应用：,1. 研究植物细胞的特性和潜力，了解细胞间的相互关系，研究细胞的分化、发育和形态发生机理。,2. 建立起具有某
8、些优良特征的单细胞无性系,3.大规模培养细胞，进行次生代谢产物生产。,4.诱导细胞分裂形成细胞团，再分化成完整植株。,第四章 植物细胞培养,19,本章主要内容,1. 单细胞分离 2. 悬浮培养 3. 单细胞培养技术 4. 植物细胞大规模培养与次生产物生产,第四章 植物细胞培养,20,Haberlandt：,观点：,首次进行离体细胞培养,高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞,小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞,21,第一节 单细胞分离,由完整的植物器官分离单细胞（叶片） 由培养的愈伤组织中分离单细胞机械法 酶解法,材料,方法,22,23,24,25,加果胶酶,26,2.由组织器官
9、经愈伤组织分离单细胞,步骤：,1） 诱导产生愈伤组织； 2） 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织松散性；,茎段,第一节 单细胞分离,27,3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物,28,一、悬浮培养的概念及特点 二、悬浮培养类型和方法,第二节 细胞悬浮培养,29,一、悬浮培养的概念及特点,1.概念：悬浮培养是指将游离细胞或细小的细胞 团在液体培养基中进行培养的方法。,第二节 细胞悬浮培养,30,2. 特点： 培养细胞不断增殖、生长速度快，适于生产次生代谢产物 能大量提供分散性好且较为均匀的细胞 大规模悬浮培养需要配置大型摇床、连续培养装置、生物反应器等,第二节 细胞悬浮培养
10、,31,二、悬浮培养类型和方法,第二节 细胞悬浮培养,成批培养,连续培养,32,（一）、成批培养,1. 概念：是指细胞接种在一定容积培养基的密封系统中培养，当培养基中主要营养成分耗尽时，细胞即停止生长，完成培养过程的方法。含义：将细胞培养在一定容积的密闭容器中进行培养。,第二节 细胞悬浮培养,33,2. 成批培养的特点,培养系统密闭培养基体积固定，当其中的主要营养物质耗尽时，细胞即停止生长，因此，丛开始培养一定起始密度的细胞到细胞停止生长这一过程称为一个培养周期。细胞数目、总重量、DNA含量变化，呈一个“S”型曲线。,第二节 细胞悬浮培养,34,第二节 细胞悬浮培养,细胞生长“S”型曲线,35
11、,“S”型曲线,延迟期：细胞较少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关。 对数生长期：细胞进入活跃分裂、数目迅速增加的状态； 减缓期：细胞分裂逐渐减慢，营养消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少。 静止期：细胞生长几乎停止，数目极少增加，甚至开始死亡。,第二节 细胞悬浮培养,36,成批培养的特点,为使成批培养细胞不断增殖，必须在悬浮培养液达最大重量时尽快进行继代培养，使细胞一直保持对数生长。 需搅拌，以使游离细胞和小细胞团在培养基中均匀分布。总之：成批培养中细胞生长和代谢方式以及培养基成分在不断改变，没有一个稳定的细胞生长期，细胞代谢物和酶浓度不能恒定。,第二节 细胞悬浮培养,
12、37,3. 成批培养的方法,(1)旋转培养 (2)往返震荡培养 (3)旋转震荡培养 (4)搅动培养,第二节 细胞悬浮培养,38,（二）、连续培养（Continuous culture）,第二节 细胞悬浮培养,含义：指在培养过程中，以不断排出悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。,39,连续培养示意图,第二节 细胞悬浮培养,40,1、连续培养的特点：,（1）新鲜培养基的不断加入,保证了养分的充分供应，可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中； （2）通过调节流入与流出培养液速度可使培养细胞生长速率相对一致，形成一个稳定的培养状态； （3）适于大规模工业化生产
13、,第二节 细胞悬浮培养,41,(1)半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液 (2)连续培养：开放式和封闭式,第二节 细胞悬浮培养,2、连续培养的种类：,42,开放式连续培养：,细胞随排出液一起流出，且速度恒定。在稳定状态下，流出的细胞速率等于培养系统中新细胞的增长速率。 开放式连续培养系统中保持细胞恒定的方式分为浊度恒定法和化学恒定法。,第二节 细胞悬浮培养,43,用途更广泛的是开放式连续培养,浊度恒定法：即选定一种细胞密度，定量测定培养液中的细胞混浊度，通过控制培养液流入量使悬浮培养浊度恒定。 化学恒定法：是将新鲜培养基的某一种营养液或营养成分调节为生长限制
14、因子浓度，并以恒定速率输入，从而使细胞增殖保持在一种稳定状态中。,第二节 细胞悬浮培养,44,封闭式连续培养：,细胞随排出液流出后再用机械方法收集起来，放入原培养系统中，故培养系统中细胞数量在不断增加。,第二节 细胞悬浮培养,45,第三节 单细胞培养,第三节 单细胞培养,46,单细胞培养常用的方法：,第三节 单细胞培养,47,（一）、看护培养法（Nurse culture）,用途：诱导形成单细胞系。,第三节 单细胞培养,含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。,1 看护培养的含义及用途,48,看护培养图示：,单细胞无性系,恒温培养1个月,23月,用一块活跃生长的
15、愈伤组织来看护单个细胞，并使 其生长和增殖。这个愈伤组织称块为看护愈伤组织,第三节 单细胞培养,49,2 看护培养基本技术,（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。 （2）在无菌条件下，将一小块（1cm3）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm）已灭菌的滤纸，放置一晚上。 （3）将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上。 （4）恒温培养。,第三节 单细胞培养,50,优点： （1）简便易行。 （2）效果好，易于成功。 缺点： （1）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。,第三节 单细胞培养,3、看护培养特点：,51,1 微室培养的含义及用途,用途:主要用来观
16、察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。,（二）、微室培养法（Microculture）,第三节 单细胞培养,含义:将单细胞培养在少量的培养基中。,52,微室培养图示：,1滴含单细胞培养液,周围加石蜡油,凹穴载玻片,旁边加石蜡油,盖盖玻片,盖盖玻片,平视图,第三节 单细胞培养,53,第三节 单细胞培养,2 微室培养特点：,优点： 在培养过程中，可以连续进行显微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程 缺点： 培养时间较短,54,（三）、平板培养法（Plante Culture）,1 含义及用途：,第三节 单细胞培养,含义:将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。
17、,用途:分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。,55,2 特点,第三节 单细胞培养,固体平板培养图示：,优点： （1）可以定点观察； （2）分离单细胞系容易； 缺点： （1）培养细胞气体交换不畅。,56,(1)、悬浮细胞密度的调制平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为110 -10010 个/ml 。,第三节 单细胞培养,3 平板培养的基本技术,初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度,57,1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养液=0.7 % 琼脂条件培养基。,条件培养基：
18、曾悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基。,第三节 单细胞培养,（2）培养基配制,58,第三节 单细胞培养,植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。,(4) 培养： 26置暗处培养21天。低倍显微镜观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。,（3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板。,59,1、条件培养基 2、细胞密度(临界密度) 3、生长激素 4、pH 5、CO2,二、影响单细胞培养的因子,第三节 单细胞培养,60,第四节,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,
