1、第四章 中药制剂的卫生学检查,第四章中药制剂的卫生学检查,微生物限度检查法,活螨检查法,热原检查法,中药制剂的卫生学检查,无菌检查法,概述,细菌内毒素检查法,第四章中药制剂的卫生学检查,概述,第四章中药制剂的卫生学检查, 概述,一、细菌,第四章中药制剂的卫生学检查,微生物按其形态分为, 概述,球菌 杆菌 螺形菌,真核细胞型 如真菌 原核细胞型 如细菌 非细胞型 如病毒,微生物按其结构特点,第四章中药制剂的卫生学检查,细菌的基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞细胞核 细菌的形态学检查：涂片、干燥、固定、染色, 概述,细菌的生长繁殖条件,充足的营养：水、无机盐、碳源、氮源、生长因子。 适宜的酸碱度：一般
2、为pH7.27.6；另外：霍乱弧菌为pH8.49.2；乳酸杆菌为5.0左右。 适宜的温度 必要的气体环境。,细菌的繁殖方式与速度,繁殖方式：二分裂法 繁殖分为四个时期：迟缓期、对数生长期、稳定期、衰退期,细菌的代谢产物,毒素：细菌能产生对机体有害的毒素。内毒素由G-菌产生，外毒素多由G +菌产生，但少数G-菌也能产生外毒素。 侵袭性酶：某些细菌能产生侵袭性酶，损伤机体组织，如金葡球菌产生的血浆凝固酶等。 热原质：许多G-杆菌及少数G +杆菌，能产生一种耐热物质，注入人体或动物体内可致发热反应，称为热原质。特点：耐高温，一般的高压蒸气灭菌法不易破坏。可用蒸馏、吸附、滤过等方法除去液体中的大部分热
3、原质。,细菌的代谢产物,色素：许多细菌在一定条件下产生色素，如金葡菌、绿脓杆菌等，可用以鉴别细菌。 抗生素：指某些微生物在代谢过程中产生的，能选择性掏和杀灭它种生物细胞的代谢产物。 细菌素：某些细菌能产生一类具有抗菌作用的蛋白质，其抗菌范围狭窄，仅对近缘细菌有抗菌作用，主要用于细菌的分裂和流行病学调查。,分解代谢产物,糖代谢产物：主要有酸类（甲酸、乙酸和乳酸）、醇类（乙醇、丁醇、乙酰甲基甲醇等）、酮类和气体（二氧化碳、氢气）。例如大肠埃希菌能分解乳糖和葡萄糖，产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖，产酸不产气。 蛋白质代谢产物：如大肠埃希菌能分解色氨酸产生靛基质；沙门菌能分解胱氨酸等含硫氨基酸产生硫
4、化氢气体。,细菌的生理学检验,培养基的种类：基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基。 常用的培养基的制备程序：配料、溶化、调整pH值、滤过、分装、灭菌、检定、保存等步骤。 细菌的接种方法：平板曲线划线法、斜面接种法、倾注平板法、穿刺接种法 细菌的培养方法：一般培养法、二氧化碳培养法、厌氧培养法,第四章中药制剂的卫生学检查, 概述,二、真菌,真菌,真菌的菌落分类： 酵母型菌落 酵母样菌落 丝状菌落 多细胞真菌,单细胞真菌,第四章中药制剂的卫生学检查,微生物限度检查法,第四章中药制剂的卫生学检查, 微生物限度检查法,一、染菌限度检查原则,微生物限度检查法,染菌限度检验原则 常用
5、稀释液、试液、指示液及培养基（自学） 细菌、霉菌及酵母菌计数 控制菌检查 微生物限度标准,染菌限度检验原则,无菌操作室技术要求： 1.无菌操作室应为单向流空气区域，附近应无污染源。 2.无菌操作室内环境洁净度应达到1万级，操作台面的洁净度应达到100级。室内温度应控制在252，湿度应控制在4560%。 3.检验全过程应严格遵守无菌操作，防止再污染。,染菌限度检验原则,供试品抽样、保存及检验量 按批号随机抽样，每批取检验用量的3倍量。 检验量：指一次检验所需的供试品量. 除另有规定外， 固体和半固体制剂的检验量为10g； 液体制剂为10ml；采用沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。
6、中药膜剂为50cm2(不得少于4片)；,染菌限度检验原则,贵重药品、微量包装药品的检验量可酌减，但内服药不得低于3g； 外用药不得低于5g； 所用的剂量的检验量必须取自2个以上的最小包装单位。 取供试品检验时，应注意摇匀，以便均匀取样。,染菌限度检验原则,供试液的制备 液体供试品：取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。油剂可加入适量无菌TW-80。 固体、半固体或黏稠性供试品：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜方法混匀后，作为1：10的供试液。,染菌限度检验原则,非水溶性供试品:方法1
7、：取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超过45）5g 司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为120 的供试液。 方法2： 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇510 分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为110 的供试液。,染菌限度检验原则,膜剂供试品:取供试品50cm
8、2，剪碎，加50ml或100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液浸泡，振摇，作为1：10或1：20的供试液。 肠溶或结肠溶制剂的供试品：取供试品10克，加pH6.8无菌磷酸盐的缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置451水浴中，振摇，溶解，作为1：10的供试液。,染菌限度检验原则,具抑菌活性的供试品：培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml 供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml 供试液
9、所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml 供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。,染菌限度检验原则, 离心沉淀法 取一定量的供试液， 500 转/分离心3 分钟，取全部上清液混合，用于细菌检查。 薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。 中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。,染菌限度检验原则,气雾剂、喷雾剂供试品：取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1 小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室
10、温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml 的供试品，再稀释成110 的供试液。,第四章中药制剂的卫生学检查, 微生物限度检查法,二、常用稀释液、试液、指示液及培养基,第四章中药制剂的卫生学检查, 微生物限度检查法,三、细菌、霉菌及酵母菌计数,细菌、霉菌及酵母菌计数,计数方法的验证 检查方法 注意事项,细菌、霉菌及酵母菌计数,计数方法的验证在建立药品微生物限度检查方法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细
11、菌、霉菌及酵母菌数测定。,细菌、霉菌及酵母菌计数,菌种： 菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代）。 大肠埃希菌（Escherichia coli） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 白色念珠菌（Candida albicans） 黑曲霉（Aspergillus niger）,cfu：细菌（可见）和真菌的测量单位。cfu:colony-forming unit,菌落形成单位，将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后，每
12、一活细胞就形成一个菌落。与常规利用显微镜对微生物数量进行测量不同，主要是对可见（即多数情况下形成菌落）的细菌数量进行测量的单位。 意思就是每毫升菌液中含有多少单细胞！ 传统上就叫“个”。但是，我们知道，一个菌落并不一定是一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一个细菌团）所生成，这时候再叫“个”就不太准确啦，准确的叫法就是“菌落形成单位”，英文缩写“CFU”。就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，数量上没有变化。,补充学习,细菌、霉菌及酵母菌计数,菌液制备： 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，培养1824h。 接种白色念球菌的新鲜培养物至改良马丁
13、培养琼脂培养基中，培养2448h 将培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu（菌落数）。,细菌、霉菌及酵母菌计数,接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁培养琼脂培养基中，培养57天，加入35ml的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液至无菌的试管中，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数为50100cfu的孢子悬液。,细菌、霉菌及酵母菌计数,验证方法 验证试验至少要进行3次独立的平行试验，并分别计算每次试验的回收率。 可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。,细菌、霉菌及酵母菌计数,（1）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml 和
14、50100cfu 试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。（加样回收试验） 薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。（加样回收试验） （2）菌液组 测定所加的试验菌数。,细菌、霉菌及酵母菌计数,（3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。,细菌、霉菌及酵母菌计数,（4）稀释剂对照组 ：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 试
15、验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml 供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。,细菌、霉菌及酵母菌计数,结果判断 ：在3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。 若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数； 若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方
16、法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。,检查方法,包括平皿法和薄膜滤过法两种，按已验证的方法进行供试品的细菌、霉菌与酵母菌数的测定。取按验证的方法制备的均匀供试液，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成 1：10、 1：100、 1：1000等稀释液。,检查方法,平皿法： 供试液的稀释：将各类制剂制备成1：10供液，再将其稀释10倍、100倍、1000倍，选择适宜的连续23个稀释级的供试液。 倾注培养基：取供试液1ml,置平皿中，注入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混合均匀，凝固后，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制行2个平板。 阴性对照试验：用稀释
17、液作对照实验,检查方法,培养和计数：细菌培养48小时后计数，霉菌和酵母菌培养72小时后计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个夹板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。,检查方法,一般营养琼脂培养基用于细菌计数； 玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数； 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。,检查方法,特殊情况： 若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数；然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和
18、酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。 含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。,菌数报告规则,细菌宜选取平均菌落数在30300之间的稀释级, 霉菌宜选取平均菌落数在30100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。 如有1个稀释级在30300(30100)之间时,将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；,菌数报告规则,如同时有2个稀释级在30300(30100)之间时，按下式计算两级比值。比值,高稀释级的平均菌落数稀释倍数,低稀释级的平均菌落数稀释倍数,菌数报告规则,当比值2时，以两稀释
19、级的均值报告 当比值2时，以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30300之间时,以后2个稀释级计算级间比值报告； 如各稀释级的平均菌落数均不在30300之间，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；,菌数报告规则,如各稀释级平均菌落数均在300(100)以上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告； 如各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告。 如当1:10（或1:100 ）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1:10稀释级）时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。,注意事项,1、所测菌只包括了在上述培养基上生
20、长的嗜中温、需氧和兼性厌氧菌的菌落总数。 2、所用的器具必须严格灭菌。 3、在无菌的环境下完成试验。 4、灭菌的试管和玻璃瓶每次打开和关闭都需用火焰灭菌。 5、忌用手接触标本及已灭菌的器材内部。,第四章中药制剂的卫生学检查, 微生物限度检查法,四、控制菌检查,控制菌检查,控制菌包括： 大肠埃希菌、大肠菌群、铜绿假单胞菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、梭菌,控制菌检查,大肠菌群：多种与粪便污染有关的需氧及兼性厌氧菌革兰阴性无芽胞杆菌，包括大肠埃希菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠埃希菌和大肠菌群被列为粪便污染指示菌，是口服药品的控制菌之一。,自学,控制菌检查,沙门菌是人畜共患的肠道传染
21、病病原体。易引发伤寒、副伤寒、食物中毒和败血症等疾病。 绿脓杆菌是常见的化脓性感染菌，并对许多抗菌药物有天然的耐药性。烧伤、烫伤、眼科疾患及其他外伤，常由该菌引起继发性感染，眼科用制剂及一般外用药，不得检出绿脓杆菌。 金葡球菌是化脓性感染的主要病原菌，外用药品和滴眼剂不得检出金葡球菌。 梭菌为芽孢杆菌科梭菌属多种细菌，梭菌中的主要病原菌有破伤风梭菌、气性坏疽菌群和肉毒杆菌等。均能产生强烈的外毒素，使人和动物致病。,自学,控制菌检查方法的验证,菌种： 标准菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌。 对实验菌种的要求同细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证。,控制菌检查
22、方法的验证,菌液的制备：接种大肠埃希菌、金葡球菌、乙型副伤寒沙门菌、绿脓杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，接种生孢梭菌的极端负责培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养1824小时，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数10100cfu的菌悬液。 验证方法：试验组（加样回收法）；阴性菌对照组（验证该控制菌方法的专属性）,控制菌检查方法的验证,结果判断： 阴性菌对照组不应检出阴性对照菌。 若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。若试验组未检出试验菌，则应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜滤过法、中各法等到方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活
23、性，并并重新进行方法验证,控制菌检查,大肠埃希菌 除另有规定外，取供试液10ml(相当供试品1g、1ml 、10cm2),直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养1824小时，必要时可延长至48小时。,控制菌检查,取上述培养物0.2ml，接种至5ml 4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在365nm紫外光灯下观察，同时用未接种的MUG培养基作为对照。 若管内培养物有荧光，为MUG阳性，无荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性，呈试剂本色，则为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴
24、性。,控制菌检查,大肠杆菌(Escherichia coli) 取胆盐乳糖培养基3份，每份各100ml,2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作空白对照。培养1824小时（必要可延至48小时）。空白对照应无菌生长。其余2份培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板,培养1824小时。当阳性对照的平板呈阳性菌落时,供试品的平板无菌落生长,或有菌落但不同于表中所列的特征,可判为未检出大肠杆菌。,控制菌检查,结果判断： 如MUG和靛基质均为阳性，则供试品中检出大肠埃希菌； 如MUG和靛基质均为阴性，则供试品中未检出大肠埃希菌； 如果MUG和
25、靛基质一阴性一阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养1824小时。 若平板上无菌落生长，或生长的菌落与下表的菌落形态特征不符，则供试品未检出大肠埃希菌；若有疑失，应对可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。,控制菌检查,大肠埃希菌菌落形态特征 培养基 菌 落 形 态 曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽。 麦康凯琼脂 鲜桃红色或微红色，菌落中心深桃红色， 圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。,控制菌检查,大肠
26、菌群 取含适量（不少于10ml）的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入1：10的供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml）、 1：100的供试液1ml（含供试品0.01g或0.01ml）、 1：1000的供试液1ml（含供试品0.001g或0.001ml），另取1支胆盐乳糖发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养1824小时。,控制菌检查,结果判断： 胆盐乳糖发酵管若无菌生长，或有菌生长但不产酸产气，则未检出大肠菌群； 若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养1824小时。 若平板上无菌落生长，或生长的菌落与下表的菌落形态特征不
27、符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，则未检出大肠菌群； 如若平板上生长的菌落与下表的菌落形态相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。,控制菌检查,大肠菌群菌落形态特征 培养基 菌 落 形 态 曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。 麦康凯琼脂 鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起， 边 缘整齐，表面光滑，湿润。,控制菌检查,确证试验：从上述分离平板上挑选45个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养2448小时，若产酸产气，则检出大肠菌群。 根据大肠菌群的检出管数，按下表报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。,控制菌检查,可能的大肠菌群数,+代
28、表检出大肠菌群， -未代表检出大肠菌群,控制菌检查,沙门菌(Salmonella species) 取供试品10g或10ml,直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养1824小时。 取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养1824小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂或（曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养1824小时，必要时可延长至4048小时。若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于下表所列特征，则供试品未检出沙门菌。,控制菌检查,沙门氏菌菌落形态特征 培养基 菌 落 形 态 胆
29、盐硫乳琼脂 无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色。 沙门氏、志贺 无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色。 菌属琼脂 曙红亚甲蓝琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落。 麦康凯琼脂 无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色。 ,控制菌检查,若平板上生长的菌浇与上表所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选23个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养2448小时。 如斜面未见红色、底层未见黄色，或斜面黄色、底层无黑色，则供试品未检出沙门菌。否则应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门
30、菌。,控制菌检查,绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa) 取供试液10ml(相当供试品1g、1ml 、10cm2),直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养1824小时。 取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三四铵琼脂培养基的平板上，培养1824小时。 绿脓杆菌的典型菌落呈扁平无定形，灰白色，表面湿润，周边时有蓝绿色素扩散。,控制菌检查,如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落特征不符，则供试品未检出绿脓杆菌。 如平板生长的菌落特征与上述菌落特征相符或疑似，应挑选23个菌落群，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养1824小时。取斜面培养物进行革兰染色
31、、镜检及氧化酶试验。,控制菌检查,氧化酶试验取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取营养琼脂培养基斜面培养物涂于滤纸片上，再滴加新配制的1二甲基对苯二胺盐酸盐试液,在30秒内呈粉红色逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性。否则为阴性。如证实为非革兰氏阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均可判为未检出绿脓杆菌。否则，应进行绿脓菌素试验。,控制菌检查,绿脓菌素(Pyocyanin) 试验取上述琼脂斜面培养物，接种于绿脓菌素专用PDP琼脂培养基斜面上，培养24小时后，在试管内加氯仿35ml,搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,将氯仿移至另一试管中，加入1mol/L盐酸溶液约1ml,振摇后，静置片刻，如在盐酸溶液层内出
32、现粉红色，即为绿脓菌素阳性。同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。,控制菌检查,若上述疑似菌为革兰阴性无芽胞杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，则供试品检出绿脓杆菌。 若上述疑似菌为革兰阴性无芽胞杆菌、氧化酶试验阳性，但绿脓菌素试验阴性，应进行适宜的生化试验，确认是否为绿脓杆菌。,控制菌检查,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 取供试液10ml(相当供试品1g、1ml 、10cm2),直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基中，培养1824小时，必要时可延长至48小时。 取上述培养物，划线接种于
33、卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养2472小时。 若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于下表所列特征，则供试品未检出金黄色葡萄球菌。,控制菌检查,金黄色葡萄球菌菌落形态特征 培养基类型 菌 落 形 态卵黄氯化 金黄色、圆形凸起，边缘整齐，外围有琼脂 钠琼脂 卵磷脂分解的白色沉淀圈，菌落直径12mm甘露醇氯化金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有琼脂 钠琼脂 黄色环，菌落直径约0.71mm ,控制菌检查,如平板生长的菌落特征与上述菌落特征相符或疑似，应挑选23个菌落群，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养1824小时。进行血浆凝固酶试验。,控制菌检查,血浆凝固酶试验取灭菌小试
34、管3支，各加入血浆无菌水(1:1)0.5ml，1支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml,其余2支作对照管；1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照;另1支加入营养肉汤或0.9氯化钠溶0.5ml作阴性对照。将3管同时培养。3小时后开始检查,以后适当时间逐次观察直至24小时。阴性对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性；阳性对照管和空白对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。当阴性对照和阳性对照符合要求，供试品的菌株为革兰氏阳性球菌、血浆凝固酶试验阳性，判定为检出金黄色葡萄球菌。,控制菌检查,梭菌（Clostridium
35、 ） 取供试液10ml(相当供试品1g、1ml )2份，其中一份80保温10分钟后迅速冷却，上述2份供试液直接或处理后接种于100ml的0.1%新鲜疱肉培养基中，各培养基管在厌氧条件下培养7296小时。 如试验管不出现混浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，则供试品未检出梭菌。 若有混浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，应取上述培养物0.2ml，涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在厌氧条件下培养4872小时。若平板上无菌落生长，则供试品未检出梭菌，若平板上有菌落生长，应挑选23个菌菌落进行革兰染色和过氧化氢酶试验。,控制菌检查,过氧化氢酶试验： 取上述平板上的菌落，轩洁净玻片上，滴加3%过
36、氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。 若上述可疑菌落为革兰阴性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化氢酶阴性，则供试品检出梭菌。否则未检出梭菌。,控制菌检查,结果判断： 1、供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。 2、供试品的细菌数、霉菌、酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，单独复试两次，以3次结果的平均值报告均数。 3、眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不得长菌，方可确定供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下的规定。 4、若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数、控制菌三项检验结果表明均符合该品种项
37、下的规定，则供试品符合规定，若其中任何一项不符合规定，则供试品不符合规定。,第四章中药制剂的卫生学检查, 微生物限度检查法,五、微生物限度标准,微生物限度标准,制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂，应符合无菌检查法规定。 用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂，应符合无菌检查法规定。,口服给药制剂,口服给药制剂,局部给药制剂,局部给药制剂,微生物限度标准,1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定。 2.口服给药制剂 细菌数：每1g不得过1000个cfu。每1ml不得过100个cfu。 霉菌和酵母菌数：每1g或1ml不得过100个cfu。 大肠埃希菌：
38、每 1g 或 1ml 不得检出。,微生物限度标准,3.局部给药制剂 3.1 用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂 应符合无菌检查法规定。 3.2 眼部给药制剂 细菌数 每 1g 或 1ml 不得过 10 个 cfu。 霉菌和酵母菌数 每 1g 或 1ml 不得检出。 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌每 1g 或 1ml 不得检出。,微生物限度标准,3.3 耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂 细菌数 每 1g、1ml 或 10cm2不得过 100 个 cfu。 霉菌和酵母菌数 每 1g、1ml 或 10cm2不得过 10 个 cfu。 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每 1g、1ml 或 10c
39、m2不得检出。 大肠埃希菌 鼻及呼吸道给药的制剂，每 1g、1ml 或 10cm2不得检出。,微生物限度标准,3.4 阴道、尿道给药制剂 细菌数 每 1g、 1ml 或 10cm2不得过 100 个 cfu。 霉菌和酵母菌数 每 1g、 1ml 或 10cm2应小于 10 个 cfu。 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 、梭菌 、白色念珠菌 每 1g、 1ml 或10cm2不得检出。,微生物限度标准,3.5 直肠给药制剂 细菌数 每 1g 不得过 1000 个。每 1ml 不得过 100 个 cfu。 霉菌和酵母菌数 每 1g 或 1ml 不得过 100 个cfu。 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、
40、大肠埃希菌 每 1g 或 1ml 不得检出。,微生物限度标准,3.6 其他局部给药制剂 细菌数 每 1g、1ml 或 10cm2不得过 100 个 cfu。 霉菌和酵母菌数 每 1g、1ml 或 10cm2不得过 100 个 cfu。 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每 1g、1ml 或 10cm2不得检出。,微生物限度标准,4.含动物组织脏器（包括提取物）的口服给药制剂 每 10g 或 10ml 还不得检出沙门菌。 5.有兼用途径的制剂应符合各给药途径的标准。 6.霉变、长螨者以不合格论。 7.原料及辅料参照相应制剂的微生物限度标准执行。,第四章中药制剂的卫生学检查,活螨检查法,活螨检查法,活
41、螨的检查一般检查法各剂型中药制剂活螨的检查 活螨卵的检查,第四章中药制剂的卫生学检查, 活蟥检查法,活螨的检查,活螨的一般检查法,漂浮法：取供试品放在盛有饱和食盐水的扁形称量瓶或适宜的容器内，加饱和食盐水至容器的三分之二处，搅拌均匀，置10倍放大镜或实体显微镜下检查，或继续加饱和食盐水至瓶口处（为防止盐水和样品溢出污染桌面，宜将上述容器放在装有适量甘油溶液的培养皿中），用洁净的载玻片盖在瓶口，使玻片与液面接触，沾取液面上的漂浮物，迅即反转玻片，置显微镜下检查。,活螨的一般检查法,直检法：取供试品先用肉眼观察，有无疑似活螨的白点或其他颜色的点状物，再用5-10倍放大镜或实体显微镜检视。有螨者，用
42、解剖针或发丝针或小毛笔挑取活螨 放在滴有一滴甘油溶液的载玻片上，置显微镜下观察。,活螨的一般检查法,分离法：也称烤螨法。取供试品放在附有孔径大小适宜的筛网的普通玻璃漏斗的下口处，利用活螨避光怕热的习性，在漏斗的广口上面放一个60100W的灯泡，距离药品6cm处，照射12小时，活螨可沿漏斗底部细颈内壁向下爬，用小烧杯装斗杯稀甘油，放在漏斗的下口处，收集爬出的活螨。,第四章中药制剂的卫生学检查,热原检查法,各剂型中药制剂活螨的检查,供试品取样量，一般供试品每批抽检两瓶。以单剂量，一日剂量包装的样品，每批抽取两盒，贵重或微量包装的供试品，取样量可酌减。必要时，可再次抽样，或选取有疑问的样品进行检查。
43、,各剂型中药制剂活螨的检查,大蜜丸：将药丸外壳置酒精灯小火焰上转动，适当烧灼（杀灭外壳可能污染的活螨）后，小心打开。 表面完好的药丸，可用消毒的或在火焰上烧灼后放冷的解剖针刺入药丸，手持解剖针，在放大镜或实体显微镜下检查。同时注意检查丸壳的内壁或包丸的油纸有无活螨 。 有虫粉现象的药丸，可用放大镜或实体显微镜直接检查，也可用漂浮法检查。,各剂型中药制剂活螨的检查,小蜜丸、水丸：表面完好的丸，可将供试品放在预先衬有洁净黑纸片的培养皿或小搪瓷盘中，用直检法检查。如未检出螨时，认为有必要，也可再用漂浮法或烤螨法检查。 有虫粉现象的丸，片，可用直检法或漂浮法检查。同时注意检查药瓶口内壁与内盖有无活螨。
44、,各剂型中药制剂活螨的检查,散剂、颗粒剂和胶囊剂 ：先直接检查药品内盖及塑料薄膜袋的内侧有无活螨。后将药品放在衬有洁净黑纸的培养皿或搪瓷盘里，使成薄层，直接检查。必要时可再用漂浮法检查。并注意检查药瓶口内壁是否有螨。,各剂型中药制剂活螨的检查,块状冲剂：直接检查供试品的包装蜡纸，玻璃纸或塑料薄膜及药块表面有无活螨。有虫粉现象者，除用直检法检查外，可再用漂浮法检查。,各剂型中药制剂活螨的检查,液体制剂及半固体制剂：先用75%乙醇将药瓶的外盖螺口周围消毒后，小心旋开外盖，用直检法，检查药瓶外盖的内侧及瓶口内外的周围与内盖有无活螨。,各剂型中药制剂活螨的检查,结果判断：凡供试品按上述有关剂型项下规定
45、检查，发现活螨者，作检出活螨报告。 注意事项 1、螨在春夏和秋冬相交季节，繁殖旺盛，爬行活跃，易于检出，在寒冬时则活动微弱甚至不动。鉴别时，可在灯光下检查，光和热的刺激促使其活动，利于检查。 2、活螨多为略带白色，晶亮的囊状小体，以暗色背景相衬，十分明显，故检查时一定要注意与背景的反差，白色的背景常常掩盖螨的发现。 3、每次检查后的供试品，器皿和用具，特别是阳性供试品，应及时用焚烧，加热等法处理，杀灭活螨，以免污染操作环境及人体。,热原检查法,本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。,第四章中药制剂的卫生学检查,
46、 热原检查法,一、供试用的家兔,热原检查法,供试用家兔 供试用家兔 供试用的家兔应健康合格。体重 1.73.0kg以上，雌兔应无孕。 预测体温前 7 日即应用同一饲料饲养, 在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常现象。未曾用于热原检查的家兔； 或供试品判定为符合规定,但组内升温达 0. 6的家兔；或 3 周内未曾使用的家兔，均应在检查供试品前 37 日内预测体温，进行挑选。,热原检查法,供试用家兔 挑选试验的条件与检查供试品时相同，仅不注射药液，每隔 30 分钟测量体温 1 次，共测 8 次，8 次体温均在 38. 0 39. 6的范围内，且最高与最低体温相差不超过 0. 4的
47、家兔，方可供热原检查用。 用于热原检查后的家兔，如供试品判定为符合规定，至少应休息 48 小时方可再供热原检查用，其中升温达 0. 6的家兔应休息 2 周以上。 如供试品判定为不符合规定，则组内全部家兔不再使用。,第四章中药制剂的卫生学检查, 热原检查法,二、试验前的准备,热原检查法,试验前准备 在作做热原检查前 12 日，供试用家兔应尽可能处于同一温度的环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于 53，且应控制在 1725，在试验全部过程中，实验室温度变化不得大于 3，应防止动物骚动并避免噪声干扰。 家兔在试验前至少 1 小时开始停止给食并置于宽松适宜的装置中， 直至试验完毕。,热原检查法,试验前准备 测量家兔体温应使用精密度为 0. 1的测温装置。测温探头或肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约 6cm，时间不得少于 1 分半钟， 每隔 30 分钟测量体温 1 次，一般测量 2次，两次体温之差不得超过 0. 2，以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。 当日使用的家免，正常体温应在 38. 039. 6的范围内，且同组各兔间正常体温之差不得超过 1。 试验用的注射器、针头及一切与供试品溶液接触的器皿，应置烘箱中用 250加热 30 分钟以上，也可用其他适宜的方法除去热原。,
