1、第六章 凝胶过滤,凝胶过滤,本章提要,凝胶的分类和性质 基本原理 凝胶层析操作 应用,凝胶过滤,凝胶过滤（gel filtration):,又称分子筛层析（molecular sieve chromatography)或 排阻层析。原理：凝胶具有内部网状结构，小分子物质能进入其内部，路径长，后跑出层析柱；大分子物质被排阻在外，路径短，先跑出层析柱，这样，不同大小的分子就得到了分离。,凝胶过滤,第一节凝胶的分类及性质,1.1 葡聚糖凝胶（Sephadex）交联度： 交联剂在凝胶中占的百分数。 交联度大孔径小能分离的分子量小,凝胶过滤,2) 排阻极限：不能扩散到凝胶基质内部中去的最小分子量。3)
2、分级范围：能分离的分子量范围。4) 吸水量：1g干凝胶所吸收水分的量。 如：G-50的吸收量为5.0g,凝胶过滤,5) 凝胶颗粒：用筛目表示，100200目6) 稳定性：化学稳定性高,凝胶过滤,1.2 琼脂糖凝胶（ Sepharose）,美国称：Bio-gel A 英国称：Segavac,凝胶过滤,型号：按琼脂糖的浓度，分为：Sepharose 2B（2%)，Sepharose 4B（4%)，Sepharose 6B（6%)。,凝胶过滤,CL-型交联琼脂糖凝胶：Sepharose与1,3-二溴异丙醇在强碱条件下生成； pH应用范围更广：pH314 Sepharose CL-4B：可以用作疏水层
3、析介质的基质,凝胶过滤,1.3 聚丙烯酰胺凝胶,单体：丙烯酰胺（Arc） 交联剂：N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis),凝胶过滤,理化性质：珠状颗粒，用前需溶胀； 稳定性好，pH110的缓冲液中稳定；,凝胶过滤,1.4 Sephacryl,由烯丙烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联而成。可用于分离蛋白质、核酸、多糖、蛋白聚糖等。,凝胶过滤,1.5 Superdex,由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价连接而成。理化性质： 稳定性好，pH312稳定 良好的分子筛特性,凝胶过滤,第二节 基本原理,凝胶过滤介质内部具有立体网状结构，颗粒内部有一定大小的筛孔。,凝胶过滤,凝胶床总体积：VtVoViVgVo：凝
4、胶颗粒外水体积 Vi：凝胶颗粒内水体积 Vg：干胶颗粒体积,凝胶过滤,1)分配系数Kav,表征了任何一种物质在凝胶层析中的被排阻程度。Kav（VeVo)/（Vt-Vo)Ve：洗脱体积 Vt：凝胶床总体积,凝胶过滤,Kav是判断分离效果的一个重要参数，各组分之间Kav差异越大，分离效果越好。,凝胶过滤,Kav 的测定,Kav（VeVo)/（Vt-Vo) Vt的计算：Vt=r2h或Vt=Vo+Vi+VgVo+Vi Vo:外水体积，用蓝色葡聚糖2000（M=200万）测定；Ve=Vo ？ Vi：内水体积，用小分子物质（硫酸铵等）测定，Ve=Vo+Vi ？,凝胶过滤,第三节凝胶层析操作,3.1 凝胶的选择和处理3.1.1凝胶的选择 1)型号：根据被分离物分子量大小来确定 如：脱盐：用Sephadex G-25,凝胶过滤,2)粒度：粗、中粒度：流速快、分辨率低；细粒度：分辨率高、但流速慢；,凝胶过滤,3.1.2凝胶用量的计算干胶用量柱体积/膨胀度 （再加1020%）,凝胶过滤,3.1.3凝胶的处理凝胶蒸馏水或缓冲液浸泡除去细颗粒0.5mol/L的NaOH-NaCl溶液浸泡抽滤洗至中性,
