1、1 EMSA实验 操作 （ RNA & Proteins） 1. 实验设计 首次实验为确保系统的正确工作和操作的正确性，设计将 Control System和 Test System一起电泳。 聚丙烯酰胺凝胶泳道共 10个， “#number”表示泳道序号。 Table 1. Control reactions for the expected results. Component Final Amount Control Reactions #1 #2 #3 Ultrapure Water - 12 l 11 l 9 l 10Binding Buffer 1 2 l 2 l 2 l 50%
2、Glycerol 2.5% 1 l 1 l 1 l 100mM MgCl2 5 mM 1 l 1 l 1 l 1 g/l Poly(dIdC) 50 ng/l 1 l 1 l 1 l 1% NP-40 0.05% 1 l 1 l 1 l Unlabeled EBNA DNA 4 pmol - - 2 l EBNA Extract 1 Unit - 1 l 1 l Biotin-EBNA Control DNA 20 fmol 2 l 2 l 2 l Total Volume - 20 l 20 l 20 l Table 2. Binding reactions for the Test Sys
3、tem. Component Final Amount Reactions #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 - 5L1D 5L6D W0 PP P0 P3 Ultrapure Water - 10Binding Buffer 1 2 l 2 l 2 l 2 l 2 l 2 l 2 l 1 g/l Poly(dIdC) 50 ng/l 1 l 1 l 1 l 1 l 1 l 1 l 1 l Optional: 50% Glycerol 2.5% 1 l 1 l 1 l 1 l 1 l 1 l 1 l Optional: 1% NP-40 0.05% 1 l 1 l 1 l 1 l 1
4、 l 1 l 1 l Optional: 1M KCl Optional: 100mM MgCl2 5 mM 1 l 1 l 1 l 1 l 1 l 1 l 1 l Optional: 200 mM EDTA Unlabeled Target RNA 4 pmol - - - - - - - Protein Extract 2 g - Biotin End-Labeled Target RNA 20 fmol Total Volume - 20 l 20 l 20 l 20 l 20 l 20 l 20 l 根据第一次实验结果，不同时期探针结合情况不同， 以另外两 批材料的核蛋白重复实验各一次
5、；若实验结果显示某个时期结合较为明显，可 选择结合最显著的时期的核蛋白进行下一步竞争实验验证， 设计不同浓度梯度的 Unlabeled Target DNA(cold probe)特异性 竞争结合，排除非特异性结合的可能；最后在与探针结合的蛋白的位置凝胶切下测序。 2 2. 实验准备 2.1 试剂 注意： （以下 0.1%DEPC溶液未灭活，不可重复使用） 试剂瓶 一律使用强酸过夜浸泡，并用 自来水冲洗 20 次， 超纯水冲洗 20 次 ， 并 用0.1%DEPC溶液（未灭活） 过夜浸泡， 高压蒸汽灭菌 30 min， 使用过程避免交叉污染 及引入 RNase； 电泳装置 中，电泳槽及其他接触
6、电泳液的一切设备使用 0.1%DEPC 溶液过夜浸泡，枪头、 EP 管避免引入 RNase，同时注意整个操作过程必须戴手套、口罩，任何可能引入RNase的接触都必须换掉手套； 配制试剂的溶液及容器 必须经过 DEPC 处理，容器处理同上，溶液处理时注意含 Tris的试剂不能直接加 DEPC， DEPC也能与胺及 巯基 反应， 应使用 DEPC水（已灭活）配制； 尼龙膜、滤纸、海绵 使用 0.1%DEPC 溶液浸泡于广口瓶过夜，高压蒸汽灭菌 30 min，于溶液中 保存过程中注意密封； DEPC 是 RNA酶的化学修饰剂 ，在本实验中非常重要，未灭活 DEPC具刺激性和吸入毒性，请于抽风橱操作；
7、 它和 RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性 ；DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。 DEPC能与胺和巯基反应，因而含 Tris和 DTT的试剂不能用 DEPC处理。 500 ml 5TBE（ DEPC水配 制； 0.22 m水系 滤头 过滤） ： Trizma (Tris) 27 g Boric acid 13.75 g 0.5 mol/L EDTA-Na+(pH 8.0) 10 ml或直接加 Na2EDTA 2H2O 1.86 g 超纯水 400 ml 溶解， 定容到 500 ml，室温保存，使用前用 0.22 m水系滤器 过滤 ； 25 ml 40% Acr
8、ylamide（ DEPC水配制； 丙烯酰胺 /甲双叉丙烯酰胺 ： 19 1） ： Acrylamide 9.5 g BIS 0.5 g 超纯水 10 ml 溶解，定容至 20 ml， 0.22 m水系 滤器过滤， 于棕色瓶 中 4保存 ； 1 ml 10% AP（ DEPC水配制； 过硫酸铵； 不可使用过旧的） : AP 0.1 g 去离子水 1 ml 溶解后储存于 4， 2周内有效； 50% Glycerol（ DEPC水配制； 配胶用） ： Glycerol 1 ml 去离子水 1 ml 0.22 m水系 滤器 过滤 ； 显影液 和 定影液 ： 按照试剂说明配制，可用无特殊处理的量筒配制
9、，可重复使用 34次； TEMED； EBNA Control System components； Test System samples； DEPC treated Ultrapure Water； 2.2 设备仪器 100 ml、 500 ml 量筒；电泳及转膜设备（包括冰袋和泡沫箱）；大摇床；紫外超净工作台 ； 10 ml小烧杯； 6个大培养皿；尼龙膜；滤纸；水浴锅； 250 ml锥形瓶 1个； 保鲜膜；暗盒； X-射线胶片； 0.22 m滤头 。 3 2.3 RNA探针处理 RNA探针无需退火，干粉状 RNA探针 各两管 ，一管保存于 -80，一管使用前用 DEPC水配制成溶液（注意
10、浓度），分装为可近期使用的两管，均保存于 -80。 3. 实验步骤 （以下在摇床中孵育必须使用保鲜膜密封，防止带入 RNase） 3.1 Prepare and Pre-Run Gel 制胶： 按 Table 3试剂表制 胶 （ 两块 ） 。 Table 3. 6% Polyacrylamide mini gel. Component Volume 5TBE(过滤 ) 1 ml 40% Acrylamide 1.65 ml 50% Glycerol(过滤 ) 0.5 ml TEMED 10 l DEPC Treated Ultrapure Water 6.78 ml 脱气 10 min 10%
11、 AP 60 l Total Volume 10 ml 室温放置 30 min，同时准备电泳设 备和 0.5TBE电泳缓冲液。 预电泳： 加 0.5TBE电泳缓冲液 ，静置 5 min，观察无漏，则继续加缓冲液至没过金属线； 100 V， 1315 mA预电泳（可直接调节电流，不调电压）至电流恒定， 3060 min。同时配制 0.5TBE 放入 4 冰箱预冷，为电转运作准备。 3.2 Prepare and Perform Binding Reactions 冰上解冻 EBNA Control System components和 Test System samples（不要涡旋和用手捂热）
12、 ， 使用时再 室温 解冻 EBNA Extract。 根据 Table 1和 Table 2配制 20 l体系，室温孵育 20 min。 添加 5 l 5Loading Buffer到各 20 l 反应体系 ，上下吹打数次，充分摇匀 ， 不要旋涡或剧烈混匀。 3.3 Electrophorese Binding Reactions 切断电源并冲洗胶孔，加各样品 20 l 到胶孔中 ， 打开电流（设定为 100V 为 880.1厘米凝胶），样品中溴酚蓝染料迁移电泳到凝胶长度约 2/3 到 3/4 处。在 6凝胶中游离 的biotin-EBNA Control DNA duplex位于溴酚蓝迁移
13、后面。 3.4 Electrophoretic Transfer of Binding Reactions to Nylon Membrane 0.5TBE浸泡尼龙膜至少 10 min。 按照 “（底）海绵 +滤纸 2 层 +凝胶 +尼龙膜 +滤纸 2 层 +海绵 ”将 膜等 放在一个干净的电泳转移槽中 （避免使用已被用于免疫印迹海绵） ，加 0.5TBE电泳缓冲液至没过 海绵 。 380 mA（ 100V） 转膜 4560 min，转运过程准备交联设备 ，并将 Blocking Buffer和 4Washing Buffer于 50 水浴至所有颗粒溶解 。 完成后，将膜 的溴酚蓝一侧 （与凝
14、胶相贴一面 ，即正面 ） 朝上放置于干纸巾上。 （ 在凝胶中不应有任何残留的染料）不要让膜干燥，立即进行下一步。 3.5 Cross-link Transferred DNA to Membrane 超净工作台紫外灯下 10 cm左右照射 10 min。 4 3.6 Detect Biotin-labeled DNA by Chemiluminescence Blocking Buffer和 4Washing Buffer可以在室温和 50 之间使用，保持所有的颗粒留在溶液中。 Substrate Equilibration Buffer 可在 4 和室温使用之间。 封闭膜： 尼龙膜正面朝上
15、（以下操作均保持膜正面朝上） 于培养皿中加 20 ml Blocking Buffer，并 45 rpm孵育 15 min。 准备 conjugate/blocking solution： 20 ml Blocking Buffer 中加入 66.7 l Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate （ 1:300稀释）。 倒出膜中的 Blocking Buffer，加入 conjugate/blocking solution。 45 rpm孵育 15分钟 ；同时，准备 1wash solution： 40 ml 4Wash
16、Buffer +120ml ultrapure water。 膜转移到一个新 培养皿 ，用 20 ml 1wash solution洗， 45 rpm轻轻摇动 5 min，共 洗膜4次 。 膜转移到一个新 培养皿 ，并加入 30 ml Substrate Equilibration Buffer， 45 rpm孵育 5分钟 ； 关灯： 准备 Substrate Working Solution： 6 ml Luminol/Enhancer Solution + 6 ml Stable Peroxide Solution。 注： 暴露在阳光下或任何强光都会破坏 Working Solution，
17、应保存在棕色瓶并避免长时间暴露在强光下； 短期暴露于通常的实验室灯光不会破坏溶液。 将膜从 Substrate Equilibration Buffer中取出，用纸巾小心地吸去 膜边缘 的缓冲液；将膜放在 一个干净的保鲜 膜 上；将 Substrate Working Solution倒到膜上，完全覆盖表面 ，静置孵育 5分钟 。 从 Working Solution中取出膜，将膜的一侧放到纸巾上吸 2-5 s，以除去多余的缓冲液。不要让的膜变得干燥；用保鲜 膜包裹湿润的膜，避免气泡和皱纹。 膜放置在暗盒中 2-5 min， 移至暗房， 将 3张 X-射线胶片 重叠覆盖于膜上曝光 1030 s（可根据后面结果调整曝光时间），胶片于显影液 90 s， 清水冲洗， 定影液 90 s，再用清水洗净胶片 ；根据胶片结果是否清晰，选择是否重新压片 。
