1、临床儿科杂志 第 32 卷第 9 期 2014 年 9 月 J Clin Pediatr Vol.32 No.9 Sep.2014 888 doi:10.3969 j.issn.1000-3606.2014.09.022气相色谱 - 质谱法检测遗传代谢性疾病高危患儿彭 薇 张万巧 封志纯北京军区总医院附属八一儿童医院 ( 北京 100700)摘要： 目的 了解北京地区遗传性代谢性疾病(IMD)的发病情况。 方法 利用气相色谱- 质谱法(GC-MS)对IMD高危儿进行尿液化学分析。 结果 411例 IMD高危儿中检测出代谢异常269例 (65.5%)，其中确诊IMD 19例 (4. 6%)，包括
2、甲基丙二酸血症15例，丙酸血症、高苯丙氨酸血症、尿素循环异常和焦谷氨酸尿症各1 例；疑似IMD 22例 (5.4%)，包括乳酸血症13例，原发性甘油尿症5 例，脂肪酸代谢异常4 例，Citrin缺陷症、酪氨酸血症、半乳糖血症、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症、枫糖尿症各1 例；其他代谢异常228例 (55.5%)，表现为尿乳酸、蔗糖、乳糖、半乳糖、N-乙酰酪氨酸、琥珀酸、双羧酸水平增高以及丝氨酸/ 苏氨酸比例异常等。 结论 甲基丙二酸血症为北京地区最常见的IMD ，对不能明确病因的患儿应尽早行GC-MS检测，必要时联合应用串联质谱检测和基因分析诊断。关键词： 气相色谱-质谱法； 遗传性代谢病；
3、 尿素酶预处理； 儿童Analysis of inherited metabolic disease in Beijing by gas chromatography-mass spectrometry PENG Wei, ZHANG Wanqiao, FENG Zhichun (Bayi Childrens Hospital Affiliated to Beijing Military Region General Hospital, Beijing 100700, China)Abstract: Objective To learn the incidence of the inherit
4、ed metabolic diseases in Beijing. Methods Urine samples were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（ GC-MS） for inherited metabolic diseases in high risky infants in Beijing . Results Urine samples from 411 high risky infants were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry. 269 cases
5、 (65.5%) were detected to have metabolic abnormalities, including 19 cases (4.6%) diagnosed of inherited metabolic diseases in which there were 15 cases of methylmalonic academia and 1 case each of propionic academia, hyperphenylalaninemia, urea cycle abnormality and pyroglutamic aciduria. There wer
6、e 22 suspected cases (5.4%) of inherited metabolic diseases including 13 cases of lactic acidosis, 5 cases of primary glycerol aciduria, 4 cases of fatty acid metabolic disorders including 1 case each of Citrin defects, tyrosinemia, galactosemia 3-methylcrotonoyl coenzyme A carboxylase deficiency an
7、d maple syrup urine disease. There were also 228 cases (55.5%) of metabolic abnormalities, such as increasing urine levels of lactic acid, sucrose,lactose, galactose, N-acetyl tyrosine, succinic acid, dicarboxylic acid and abnormal serine/threonine ratio. Conclusions Methylmalonic academia might be
8、the most common inherited metabolic diseases in high risky infants in Beijing. For infants with clinical manifestations but unclear etiology, GC-MS should be performed. MS-MS and gene analysis could be combined if necessary.Key words: gas chromatography-mass spectrometry; inherited metabolic disease
9、; urease pretreatment; infant新生儿代谢异常可以由早产、窒息、感染等非遗传因素引起，也可以是由于参与体内代谢的某种酶、运载蛋白、膜或受体等的编码基因发生突变，引起机体细胞和器官生化代谢紊乱，造成中间、旁路代谢产物蓄积或终末代谢产物缺乏，最终表现出一系列临床症状即遗传性代谢性疾病(inherited metabolic disorders， IMD)，又称遗传代谢异常或遗传性代谢缺陷1。该类疾病多为常染色体隐性遗传的单基因病，包括氨基酸、有机酸、脂肪酸、碳水化合物、脂质等多种类物质的代谢异常，目前已经报道的疾病种类达500多种。虽单一病种的发病率低，但其总体发病率甚高
10、(1/2 5551/784)2。 IMD的死亡率和致残率非常高 (约 50%以上) 。新生儿期起病的IMD起病急、病情重、进展迅速、病死率高，是不明原因新生儿死亡的重要原因之一1，由于临床表现缺乏特异性，常因误诊或漏诊而错过最佳治疗时机。因此专家建议，所有新生儿均应进行IMD筛查。目前新一代的气相色谱- 质谱(gas chromatography-mass 基金项目：青年科学基金项目 (No.31100603)通信作者：封志纯 电子邮箱：临床儿科杂志 第 32 卷第 9 期 2014 年 9 月 J Clin Pediatr Vol.32 No.9 Sep.2014 889 spectrome
11、tery， GC-MS)分析法可通过一次进样同时检测250余种代谢产物，诊断100余种IMD，是IMD最重要的筛查方法。本研究回顾性分析2012年 6月至2013年 5月的12个月期间对来自本院病房和门诊具有代谢紊乱相关征兆的411 例高危儿进行尿液GC-MS检测的结果。1 临床资料在 2012年 6月2013年 5月期间，对来自北京地区的具有代谢紊乱相关征兆的高危儿进行GC-MS检测。研究对象入选标准：年龄6个月；具有以下疑似IMD的临床症状，包括反复呕吐、喂养困难、腹泻、贫血、黄疸、肝脾肿大、抽搐、皮炎、异常面容、多发畸形、先天性心脏病、运动和智力发育迟缓或倒退、肌张力异常、脑瘫、嗜睡、自
12、闭、多动、听力障碍或肝肾功能异常、代谢性酸中毒、高氨血症、高胆红素血症、低血糖等；父母均知情同意。建立氨基酸、有机酸、脂肪酸、碳水化合物、脂质等代谢产物质谱图谱库，包括氨基酸、有机酸、脂肪酸、碳水化合物、脂质等5 大类共165种标准品，经甲基硅烷化衍生后进行 GC-MS分析，获得各种物质的特征保留时间和碎片离子的特征质谱图，所得质谱图通过与NIST标准谱库比对作定性分析，并编制本中心专用的中国儿童尿液代谢物谱库(CCUM)。本院病例尿液标本收集直接储存在Eppendorf管留样约1 ml，置于80冰箱保存。远程递送标本可以采用干尿液滤纸片，以去离子水洗脱，上机前处理操作同新鲜尿样。尿液样品以尿
13、素酶去尿素，加入内标十七烷酸(尿素酶和内标十七烷酸均购自美国Sigma-Aldrich公司) 后再加入无水乙醇，混匀后以离心力16 873 g，离心5 min去蛋白，上清液用氮气吹扫仪( 购自杭州奥盛 )吹干后，加入 100 l甲基硅烷化衍生剂(BSTFA+1%TMCS，购自美国Supelco公司) ， 90衍生化40 min，冷却后转移玻璃插管，上机测定( 气相色谱-质谱仪TRACE GC ULTRA-ISQ购自美国Thermo Fisher Scientific公司) 。进样口温度250，氦气( 购自 Air products公司) 流速1.0 ml/min，恒流。柱温箱起始温度60，维持
14、2 min，以10 /min的速度升温至 220，维持3 min；再以15 /min的速率升温至325，维持5 min；离子源温度280，传输线温度300，扫描范围50550 m/z。通过上述方法，尿液中各物质成分被气相分离，通过对各流出峰特征质谱图的定性和色谱峰面积的定量分析。共对411 例高危儿进行了尿液GC-MS检测和分析，其中男281例、女130例，年龄028 d 323例、16个月88例。411 例患儿中269例存在代谢异常，包括确诊IMD 19例 (4.6%)，均为新生儿；疑似IMD 22例 (5.4%)，其中新生儿18例，婴儿4 例；其他因素导致的代谢异常228例。在确诊的19例
15、 IMD患儿中，甲基丙二酸(MMA)血症15例 (占确诊病例的78.9%)，丙酸血症、高苯丙氨酸血症、尿素循环异常、焦谷氨酸尿症各1 例。对检测到的1 例尿素循环异常患儿进行基因分析，确诊患儿为鸟氨酸转氨酶缺乏症，确诊前已经死亡；另外18例未进行基因分析。15例 MMA提取的离子色谱图上首要异常指标是MMA，其出峰时间为9.38，特征离子的质荷比(mass to charge ratio， m/z)为 247；第二异常指标是甲基枸橼酸(Mecitrate)，其出峰时间为16.91，特征离子的m/z为 287和 479(图 1)。 19例 IMD的临床症状和体征总结为：呕吐7 例，黄疸7 例，低
16、血糖10例，肝脾肿大1例，肌张力异常 12例，惊厥7 例，昏迷4 例，智力/ 运动发育迟缓4 例，高血氨7 例，肝功能异常9 例，代谢性酸中毒14例，先天性心脏病3例。本组患儿中22例 (5.4%)的某些特异性标志物的检测值明显高于基准值，高度怀疑存在IMD，其中包括乳酸血症13例，原发性甘油尿症5 例，脂肪酸代谢异常 4例，Citrin缺陷症、酪氨酸血症、半乳糖血症、3-甲基巴豆酰辅酶A 羧化酶缺乏症、枫糖尿症各 1例。结合临床表现和原发病，发现22例疑似患儿中的13例乳酸血症、4 例甘油尿症和1 例半乳糖血症属于非遗传因素引起的代谢异常。乳酸血症的原发病分别为新生儿缺氧缺血性脑病5 例、新
17、生儿呼吸窘迫综合征 4例、新生儿窒息2 例、感染性休克及多器官衰竭各 1例；甘油尿症的原发病分别为白血病、感染、甲图 1 甲基丙二酸血症提取离子色谱图临床儿科杂志 第 32 卷第 9 期 2014 年 9 月 J Clin Pediatr Vol.32 No.9 Sep.2014 890 状腺功能低下和低蛋白血症各1 例；1 例半乳糖血症的原发病为癫 ；其余4 例高危儿不能确诊，其中1例甘油尿症患儿的临床资料不完善不能确诊，1 例死亡，另外2例合并其他畸形，家长放弃治疗。本组其余228例 (55.5%)代谢异常表现为尿乳酸、蔗糖、乳糖、半乳糖、N-乙酰酪氨酸、琥珀酸、双羧酸水平增高以及丝氨酸/
18、苏氨酸比例异常等。本研究确诊的19例 IMD中，目前能用饮食及药物治疗的疾病有MMA、丙酸血症及高苯丙氨酸血症。检测出的15例 MMA均为新生儿，4 例在确诊前已经死亡， 3例由于某些原因家长放弃治疗而未随访，2 例患儿家长前往外院就诊且均未合并同型半胱氨酸尿症，其余6 例患儿于我院接受VitB12试验性治疗。6 例患儿试验性治疗的甲钻胺剂量：肌肉注射l mg/d，连续36 d，随后500 g/次，每周23次，辅以低蛋白饮食 蛋白质12g/(kgd) 及左旋肉碱 3050 mg/(kgd) 静脉滴注或口服治疗，其中4 例患儿来复查 GC-MS， 2例患儿症状及体征明显好转，尿中甲基丙二酸水平显
19、著下降，另外2 例发展为严重的代谢性酸中毒，已死亡。对检测确诊的1 例丙酸血症给予低蛋白0.51.5g/(kgd) 或低丙酸前体饮食，生物素、L-肉碱和碳酸氢钠等治疗，因患儿伴有高氨血症应用血液透析和腹膜透析排除有害代谢产物，经治疗后患儿症状改善，随后就诊于外院遗传门诊继续治疗。确诊的 1例高苯丙氨酸血症经高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC) 测定血液苯丙氨酸浓度达 360 mol/L，为进一步分型患儿就诊于外院遗传门诊。另1 例焦谷氨酸尿症患儿也就诊于外院遗传门诊。2 讨论对于 IMD的研究起始于 1908年 Garrod的
20、专题论文“先天性代谢缺陷”。如今，先天性代谢缺陷、IMD以及生化遗传性疾病都是指一类可以用生化方法来检测代谢物质以及蛋白质功能的遗传性疾病。现已知 IMD是一类多由单基因缺陷引起的以代谢功能障碍为主要表现的先天缺陷。约80% 属常染色体隐性遗传，其余为X 连锁遗传、常染色体显性遗传或线粒体遗传1。本类疾病临床表现多样，半数以上在新生儿期出生后数小时或几天内即发病；部分在幼儿期、儿童期、青少年期甚至成年期发病。并且临床表现为极其类似的非特异性症状，容易误诊，最终延误诊治。IMD发病年龄越早，病情越重，病死率越高，是不明原因高危患儿死亡的重要原因之一，IMD若在出生后3 个月内得不到及时诊断、干预
21、和治疗，20%以上患儿可出现多器官和神经系统损害，若在出生6个月后才进行治疗，40%以上患儿可出现智力发育障碍。过去我国普遍采用Guthrie 细菌抑制法进行新生儿 IMD诊断，只能检测24种疾病，并且人口覆盖率不足20%。近几年来，我国加大了对新生儿IMD筛查和诊断的推进力度，北京、上海、广州、浙江、武汉等地率先建立了以GC-MS和 MS-MS等质谱技术为核心的IMD筛查实验室4，对新生儿进行IMD筛查、诊断和研究，今后必将逐步在全国展开，这将使新生儿筛查的内容和质量上升到一个新的水平。尿素酶预处理- 气相色谱- 质谱法(urease pretreat-ment-gas chromatogr
22、aphy-mass spectrometry， UP-GC-MS)由日本学者Matsumoto等开发，由于尿液只经尿素酶去尿素，不需要抽提，故能对尿液中氨基酸、有机酸、脂肪酸、碳水化合物、脂质等多种成分同时分析，减少检测物质信息的丢失。GC-MS由色谱分析和质谱分析两部分组成，既可进行物质定性，亦可进行微量(10-9 10-12 g)物质定量，测定尿液中异常代谢物质的种类及含量变化，为IMD提供诊断和治疗依据。文献报道，UP-GC-MS灵敏度较高，是目前GC-MS的主要检测方法5。本研究对411 例高危儿进行尿液 GC-MS检测和分析，发现269例 (65.5%)存在代谢异常，这与同类报道类似
23、6。 19例确诊为IMD的患儿均为新生儿，说明新生儿期是IMD(特别是有机酸尿症及氨基酸病 )的高发年龄段，对疑似病例应及时开展实验室特殊检测，达到早诊断、早治疗、降低死亡率的目标7。 MMA是先天有机酸代谢异常中最常见的疾病，为常染色体隐性遗传病。德国发病率1/80 0001/50 000，日本为 2/9 780，意大利为1/61 775，我国发病率不详8。本研究确诊的19例 IMD中有15例为MMA(78.9%，均为新生儿) ，提示MMA为北京地区高危儿最常见的 IMD，同时发现患病新生儿可能有呕吐、黄疸、低血糖、肌张力异常、惊厥、昏迷、智力/ 运动发育迟缓、高血氨、先天性心脏病、肝功能异
24、常以及酸中毒等临床表现。临床症状多，但缺乏特异性，发病急、进展快、病死率高，因此，在发病早期利用GC-MS对其做出临床诊断有重要意义9。检测出的15例 (4例在确诊前已经死亡)MMA中 3例家长由于某些原因放弃治疗，2 例就诊于外院遗传科门诊，未随访；对接受试验性治疗的6 例患儿进行3 个月到1 年的随访，其中4 例患儿来我院复查GC-MS检测，2 例患临床儿科杂志 第 32 卷第 9 期 2014 年 9 月 J Clin Pediatr Vol.32 No.9 Sep.2014 891 儿症状及体征明显好转，尿中甲基丙二酸浓度显著下降，另外2 例后来发展为严重的代谢性酸中毒，已死亡。由此可
25、见，GC-MS法尿有机酸分析是早期诊断MMA的重要依据。经过GC-MS检测确诊的另外4 例患儿， 1 例为尿素循环异常的新生儿 (目前已知尿素循环中由于酶生物合成的不同缺陷可导致的5 种疾病：鸟氨酸转氨酶缺乏症、氨甲酰磷酸合成酶缺乏症、精氨酸合成酶缺乏症或瓜氨酸血症、精氨酰琥珀酸裂解酶缺乏症和精氨酸酶缺乏症 )此例新生儿经过基因分析确诊为鸟氨酸转氨酶缺乏症，确诊前已经死亡。另外3 例患儿均就诊于外院专门的遗传门诊，临床资料丢失。通过我院GC-MS 检测确诊为IMD 的患儿多数就诊于外院专门的遗传门诊，未能及时随访，临床资料丢失，说明我院儿科门诊亟待解决的问题是需要开展专门的遗传门诊。通过对疑似
26、病例(22例，新生儿18例，婴儿4 例 )的原发病进行分析，发现其中18例 (13例乳酸血症、4例甘油尿症和 1例半乳糖血症 )患儿属于非遗传因素引起的代谢异常，另外4 例患儿仍不能确诊，需结合临床表现、其他检测及基因分析确诊，2 例患儿家长由于其他原因放弃治疗，1 例患儿已死亡，1 例患儿临床资料无法完善也不能确诊。上述结果表明，通过GC-MS检测，大部分的有机酸血症可以确诊，这为临床早期诊断有机酸血症提供了强有力的证据，同时提示高危儿中普遍存在代谢异常，这些代谢异常包括IMD、非遗传因素引起的乳酸血症和甘油尿症、其他代谢紊乱等，另外少数不能确诊的疑似IMD应联合串联质谱检测及基因分析确诊。
27、综上所述，当新生儿期遇到不明原因的呕吐、黄疸、低血糖、肌张力异常、惊厥、昏迷、智力/ 运动发育迟缓、高血氨、先天性心脏病、肝功能异常以及酸中毒等非特异性临床表现时，医师往往难以作出具体的病因诊断，此时应及早对患儿留取尿样进行 GC-MS检测，必要时联合应用串联质谱检测和基因分析诊断，及早诊断，及早治疗，减少死亡，避免或减轻不可逆的病理改变。参考文献：1 邵肖梅，叶鸿瑁，丘小汕. 实用新生儿学 M. 北京：人民卫生出版社，2011：816-840.2 Therrell BL，Adams J. Newborn screening in North Ameri-can J. J Inherit Me
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