1、第二章 酶的生物合成与发酵生产 Chapter 2 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism,酶的生产方法,提取分离法 (Extraction),生物合成 (Biosynthesis),化学合成 (chemicalsynthesis),SOD - blood Papain-Papaya Chymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cell,Amylase from Bacillus Protease from Bacillus Phosphatase from Bacillus Glucoamyl
2、ase from Aspergillus Plant cell culture Animal cell culture,Few example,Contents of Chapter 2,1.1、酶生物合成过程 自学 1.2、酶生物合成的调节 2、酶发酵动力学 3、微生物发酵产酶 4、动、植物细胞培养产酶 自学,第一节 酶生物合成及调节 一、酶的生物合成 (自学),遗传信息传递的中心法则,转录传递给RNA，再由RNA,二、原核生物酶生物合成的调节,定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。 意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。,A B,
3、E,X,底物水平 的调节,酶水平 的调节,酶活性的调节,酶含量的调节,酶的定位调节,辅助因子调节,生长发育的不同时期 外界环境变化 酶合成与分解速度的变化（基因表达调控）转录水平、转录产物加工、翻译水平、翻译产物加工、酶降解,产物调节,细胞内酶的调控模式,（一）基因调控理论 Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory）,基因操纵子调节系统示意图,调节基因 启动基因 操纵基因 结构基因DNA转录 （-）RNA聚合酶 （+） 转录翻译 mRNA翻译阻遏蛋白蛋白质诱导剂,控制区 信息区,操纵子,调节基因(regulator gene)：可产生一种组成型调节蛋白(regul
4、atory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物(effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。,cAMP-CRP复合物的作用示意图,启动基因（promotor gene）（启动子）：有两个位点： （1）RNA聚合酶的结合位点 （2）cAMP-CAP的结合位点。 CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才
5、能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。,操纵基因（Operater gene）:位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。 结构基因（Structural gene）:决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。,(二) 酶合成调节的类型1.诱导 (induction) 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。2.阻遏 (repression) 分解代谢物阻遏(catabolite repression)反馈阻遏(feedb
6、ack repression),（三）酶合成的调节机制 1. 酶合成的诱导 加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶； -半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。 实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。,调节基因,操纵基因,乳糖结构基因,P,LacZ,LacY,Laca,mRNA,阻遏蛋白（有活性）,启动子,O,R,A、乳糖操纵子的结构,B、乳糖酶的诱导,阻遏蛋白（有活性）,诱导,2.末端产物阻遏 由某代
7、谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象： 实验： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。,色氨酸操纵子酶的阻遏,调节基因,操纵基因,结构基因,mRNA,酶蛋白,阻遏蛋白不能与操纵基因结合， 结构基因表达,调节基因,操纵基因,结构基因,辅阻遏物,代谢产物与阻遏蛋白结 合，使之构象发生变化 与操纵基因结合，结构基 因不能表达,酶的诱导和阻遏操纵子模型,B.有活性阻遏
8、蛋白加诱导剂,A.有活性阻遏蛋白,C.无活性阻遏蛋白,D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂,酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比,3.分解代谢物阻遏,指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。 分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。,分解代谢物阻遏现象：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasi
9、c growth）。,这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。,分解代谢物阻遏,R,LacZ,LacY,Laca,mRNA,CAP基因,结构基因,T,CAP,O,CAP结合部位,RNA聚合酶,T,cAMP -CAP,P,CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）,使CAP呈失活状态,第二节 酶发酵动力学 一、细胞生长动力学在分批培养(batch culture)过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰
10、亡期5个阶段。,细胞生长曲线 O-A 延迟期 A-B指数生长期 B-C减速期 C-D 静止期 D-E 衰亡期,营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod模型:比生长速率（1/h） （specific growth rate） max：最大比生长速率（1/h） S：营养物浓度（生长限制基质浓度） 克/L Ks：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数 克/L，或 mol/L,二、产酶动力学 （一） 酶生物合成的模式根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式，即：同步合成型生长偶联型中期合成型部分生长偶联型延续合成型非生长偶联型 滞后合成型,1. 生长偶联
11、型（又称同步合成型）酶的生物合成与细胞生长同步。 特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。,细胞 浓度 mg/ml,酶 浓度 U/ml,单宁酶,生长偶联型中的特殊形式中期合成型酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。,枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线,2.部分生长偶联型（又称延续合成型）酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特
12、点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的mRNA相当稳定。,黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线,3. 非生长偶联型（又称滞后合成型）只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的mRNA稳定性高。,黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线,总结：影响酶生物合成模式的主要因素高：可在细胞停止生长后继1）mRNA的稳定性 续合成酶差：随着细胞停止生长而终止酶的合成 2）培养基中阻遏物的存在不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始 合成。,酶生产中最理想的合成模式： 延续合成型：发酵
13、过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。对于： 同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵 温度 。 滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。 中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。,(二) 产酶动力学 一般产酶动力学方程可表达为：,式中 X细胞浓度(g /L)细胞比生长速率(h-1)生长偶联的比产酶系数(IU/g)非生长偶联的比产酶速率(IU/(gh)E酶浓度(IU/L)t时间(h),生长偶联型,部分生长偶联型,非生长偶联型,第三节 微生物发酵产酶一、产酶微生物的分离
14、和选育1.优良产酶菌种应具备的条件（1）酶产量高（2）易培养（生长速率高、营养要求低）（3）遗传性能稳定，不易退化（4）易分离提纯（5）安全可靠（不是致病菌）,2.常用的产酶微生物,3. 产酶微生物的分离和筛选 1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品2)富集培养: 投其所好，取其所抗 3)分离获得微生物的纯培养（pure culture）。4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。,-淀粉酶的筛选,蛋白酶产生菌的获得方法,应用含酪蛋白的培养基,4.产酶微生物优良菌种的选育诱变育种 原生质体融合育种 基因工程育种,二.微生物发酵产酶方法1.固体培
15、养:特别适合于霉菌培养 2.液体培养:目前酶发酵生产的主要方式 3.固定化细胞 :需要特殊的固定化细胞反应器,三 酶的发酵工艺条件与控制 The fermentation principles and its control of enzyme production,1、培养基,2、发酵条件及控制- Transcription,3、提高产酶的措施- Translation,Go,Go,Go,下一节,本章 目录,1、培养基,各种生物对营养的需求,1、选择适宜的营养物质 2、营养物的浓度及配比合适 3、物理、化学条件适宜 4、经济节约 5、精心设计、试验比较,培养不同的微生物必须采用不同的培养条件
16、； 培养目的不同，原料的选择和配比不同； 不同阶段，培养条件也有所差异。,培养基的设计原则,五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础,培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。,任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素,构成细胞物质或代谢产物中碳架,碳源可作能源，为生命活动提供能量,常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物,异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）,水是微生物最基本的组成分（） 水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物） 水是细胞质组分，直接参与各种
17、代谢活动 调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）,水,碳源,选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制,构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ）,氮源,有机氮源,蛋白胨、酵母膏、牛肉膏,无机氮源,铵盐、硝酸盐,参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性 维持细胞结构的稳定性 调节细胞渗透压 控制细胞的氧化还原电位 有时可作某些微生物生长的能源物质,常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。,氮源,无机盐,需要注意合适的碳氮比,生长因子,生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。,分类： 化学结构分成
18、维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分 等四类,功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应,实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子,实验室的常用培养基： 细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）； 放线菌：高氏1号合成培养基培养； 酵母菌：麦芽汁培养基； 霉菌： 查氏合成培养基；,例如枯草芽孢杆菌： 一般培养：肉汤培养基或LB培养基； 自然转化：基础培养基； 观察芽孢：生孢子培养基； 产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；,枯草杆菌BF7658-淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸
19、氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。 枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%, 糠1%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%（自然pH）。 黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（pH4.45.0）。 地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉5.5%, 豆饼4%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。 黑曲霉AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基: 玉米粉6%, 豆饼粉4%, 玉米浆0.6%, 氯化钙0.5%, 氯化铵1%, 磷酸氢二钠0.2% (pH
20、5.5)。 游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05% (pH 7.2)。 桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%, 硫酸镁0.05%, 氯化钙0.04%, 磷酸氢二钠0.05%, 磷酸二氢钾0.05% (自然pH)。 黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基: 麸皮5%, 果胶0.3%, 硫酸铵2%, 磷酸二氢钾0.25%, 硫酸镁0.05%, 硝酸钠0.02%, 硫酸亚铁0.001% (自然pH)。 枯草杆菌AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基: 葡萄糖0.4%, 乳蛋白水解物0.1%, 硫酸铵1%, 氯化钾0.1%, 氯化钙
21、0.1mmol/L, 氯化镁1.0mmol/L, 磷酸氢二钠20mol/L ( 用pH7.4的Tris-HCl缓冲液配制),回本节,2、发酵条件及控制,培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。,通常培养条件： 细菌与放线菌：pH77.5 酵母菌和霉菌：pH4.56范围内生长,pH值的控制,细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。,有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的
22、pH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。,通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。,温度的控制,有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。,枯草杆菌的最适生长温度为3437,黑曲霉的最适生长温度为2832 ,溶解氧的控制,在酶的发酵生产过程中， 处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解
23、氧。,培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。,调节通气量 调节氧的分压 调节气液接触时间 调节气液接触面积 改变培养液的性质,控制溶解氧方法,回本节,菌种选育（一劳永逸）1.诱变育种 (1) 使诱导型变为组成型选育组成型突变株 (2)使阻遏型变为去阻遏型选育营养缺陷型突变株 解除反馈阻遏选育结构类似物抗性突变株 解除分解代谢物阻遏选育抗分解代谢
24、阻遏突变株2. 基因工程育种,3、提高酶产量的措施,添加诱导物,对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。,诱导物一般可以分为3类酶的作用底物酶的催化反应产物作用底物的类似物,控制阻遏物的浓度,阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。 1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。 2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。 控制阻遏物的
25、浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。,为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。,采用其他较难利用的碳源，如淀粉等,采用补料、分次流加碳源,添加一定量的环腺苷酸（cAMP）,对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。,添加表面活性剂,表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。,将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。,由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁
26、而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。,添加产酶促进剂,产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高120倍；添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。,回本节,三.微生物酶的类型1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受
27、到的调节控制少。2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。,酶发酵生产的一般工艺流程,作业,教材 P63 思考题 4.5.6.7.8,第四节 动、植物细胞培养产酶与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。,动物细胞模式图,植物细胞结构,植物、动物、微生物细胞的特性比较,三者之间的差异主要有： 植物细胞动物细胞微生物细胞。 动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。 植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。 植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。 植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。 植物、微生物和动物细胞的
28、主要目的产物各不相同。,一、植物细胞培养产酶1.植物细胞培养的特点2.培养基特点应用最广的是MS培养基和LS培养基MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基。LS培养基是在其基础上演变而来的。,3.培养方法：悬浮细胞培养 细胞株的建立；外植体与愈伤组织 扩大培养； 大罐培养；,外植体：从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。 愈伤组织：将上述外植体植入诱导培养基中，于25左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。,水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织,外植体,愈伤组织,4. 培养条件的
29、影响与控制 （1）温度 （2）pH （3）通气与搅拌 （4）光照的控制 （5）前体的添加（饲喂） （6）诱导子（elicitors）的应用,5.植物细胞培养产酶实例以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例 (1)大蒜愈伤组织的诱导选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。,(2)大蒜悬浮细胞培养将上述在
30、半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。,(3)酶的分离纯化细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。,二、动物细胞培养产酶 1.动物细胞培养的特点 细胞生长速度慢。（需添加抗
31、生素） 细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。 反应过程成本高，产品价格贵。 细胞具有锚地依赖性。 原代细胞一般繁殖50代。,2.培养基天然培养基合成培养基无血清培养基,3.培养方法 (1)悬浮培养(suspension culture) (2)贴壁培养(anchorage-dependent culture) (3)贴壁悬浮培养(pseudo-suspension culture)微载体培养(microcarrier culture)包埋(entrapment)和微囊(microencapsulation)培养结团培养(aggregate culture),4.培养条件的影响与控制 （1）温度：一般控制在36.5. （2）pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。 （3）渗透压: 应与细胞内渗透压相同。 （4）溶解氧：根据情况随时调节。,
