1、植物工厂化育苗的工厂与设备,2,第一节 实验室,一 、实验室,植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。 实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。,准备室,培养室,温 室,Text,实验室,接种室,接种室,实验室组成：,4,基本实验室布局平面图,实验台,搁架,培养架,培养架,培养架,培养架,药品及仪器柜,无菌台,无菌台,搁架,拉窗,冰箱,搁 架,水槽,电炉,门,4.5m,3.0m,3.5m,4.0m,准备室,缓冲室,无菌室,培养室,准备实验室,5,缓冲室,6,无菌室,7,无菌室,8,9,9,
2、无菌室,10,10,11,11,培养架,12,12,培养室,13,温室,14,14,第二节 仪器与设备,15,冰箱,酸度计,电炉,1.基本设备,17,天平,纯水器,18,搅拌器,19,蒸汽压力灭菌锅,2.灭菌设备,20,21,22,22,过滤灭菌装置,23,23,紫外灭菌灯管,3、无菌操作设备,超净工作台,24,25,25,超净工作台,无菌接种箱,26,恒温振荡培养箱,光照培养箱,4、培养设备,27,摇 床,28,5、细胞学鉴定设备光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜,29,倒置显微镜,光学显微镜,30,1、玻璃器皿,三、培养器皿及实验用具,培养皿,三角瓶,培养瓶,2、金属材质用具,镊子,解
3、剖刀,接种针,32,接种盘,33,33,第二节 培养基,培养基是决定植物组织培养成败的关键因素之一。培养基的构成要素通常可分为：水分；无机盐类；有机营养成分；植物生长调节物质；天热物质； pH；凝固剂等。,34,34,构成培养基的绝大部分组分为水分。在研究上，常用蒸馏水来配制培养基，而最为理想的水应该是纯水。,（一）水分,大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种 微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kgFe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种,按照国际植物生理协会的建议：所需浓度 0.5mmol/L的元素为大量元素所需浓
4、度 0.5mmol/L的元素为微量元素,35,（二）矿质元素,1.大量元素 N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。 P是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。,36,Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。,2、微量元素在微量元素中，铁的使用最大 ： 一些氧化酶的组成成分叶绿素形成的必要
5、条件使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀,38,硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长锰参与植物的光合、呼吸代谢钼参与氮素的代谢氯是光合作用水光解的活化剂微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。,39,（三）有机营养成分,培养基中的有机营养成分包括糖类物质 、维生素类 和氨基酸类。,1.碳源碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。糖类物质特点：具有热易变的性质利于吸收和利用使用浓度一般在2%5%提供能源和调节渗透压,41,2.维生素类,以各种辅酶的形式存在参与多种代谢活动对生长，分化等有很好的促进
6、作用 主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素常用维生素有VB1和VB6,42,蛋白质的组成成分有机氮源可直接被细胞吸收利用培养基中常用的是甘氨酸,3.氨基酸,43,4.肌醇,环己六醇细胞壁的构建材料参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动促进活性物质发挥作用,44,（四）植物生长调节剂,植物生长调节剂不仅可以促进植物组织的脱分化和形成愈伤组织，还可以诱导不定芽、不定胚的形成。最常用的有生长素和细胞分裂素，有时也会用到赤霉素和脱落酸。,1.生长素类,促进细胞伸长和分裂促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实诱导愈伤组织形成溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的
7、溶解效果更好常用的生长素：IAA(吲哆乙酸)NAA (萘乙酸)2,4-D(2,4，二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸),46,2.细胞分裂素类,促进细胞分裂和分化诱导胚状体和不定芽的形成延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成用于离体成花的调控 溶于0.5-1.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中 常用的细胞分裂素：KT (激动素)BA(6-卞基腺嘌呤)2-ip(异戊烯氨基嘌呤)ZT（玉米素）,47,3.赤霉素类和脱落酸,A、赤霉素类 组织培养中不常使用加速细胞的伸长生长促进细胞的分裂主要是GA3B、脱落酸抑制细胞分裂和伸长促进脱落和衰老促进休眠和提高抗逆能力,GA3,脱落酸,48,促进某些愈伤组织和器官
8、的生长化学成分不明、复杂天然营养混合物 如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物,（五）天然复合物,49,50,（六）pH,在灭菌前，培养基的pH一般被调节到5.06.0 之间，最常用的pH为5.75.8。pH过高时，培养基会变硬；pH过低时，则影响培养基的凝固。,50,（七）凝固剂,琼脂是使用最普遍的凝固剂 用量一般在6-10g/L之间 颜色以浅、透明度高好，洁净为上品除了琼脂外，在组织培养中还可以使用琼脂糖、结冷胶等。,51,（八）其他添加物,52,1.活性炭,吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质抑制外植体褐变防止玻璃苗的产生促进培养物生长和分化促进生根2.抗生素防止外植体内生菌造成的污染,活
9、性炭,53,53,二、培养基的基本类型,培养基形态不同：固体培养基、液体培养基培养过程不同：初代培养基、继代培养基其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基营养水平不同：基本培养基、完全培养基,（一）培养基的种类,成分和浓度不同：含盐量较高的培养基、硝酸钾含量较高的培养基、中等无机盐含量的培养基、低无机盐含量的培养基,54,54,1、MS培养基 无机盐浓度高高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐含有一定数量的铵盐营养丰富不需要添加更多的有机附加物,（二）几种常见培养基的特点,2、White培养基 1943年由White为培养番茄根尖而设计 1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素 无机盐
10、浓度较低使用广泛在生根培养、胚胎培养中有良好的效果,附表：White培养基,56,3、B5培养基 1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐较高的硝酸盐和盐酸硫胺素,B5培养基的组成和配方,57,4、N6培养基 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 KNO3和(NH4)2SO4含量高，不含钼,N6培养基组成及配方,58,第三章 培养基和培养条件,为了减少工作量，减小误差，最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液。,一、培养基母液的配制,60,1.配制母液原则相同类型的试剂混合；易形成沉淀的药品分开；母液浓度要适宜；用量要认真计算和核对；药品要准确称量。,
11、61,2.MS培养基母液的配制,62,MS培养基母液根据试剂特性通常配成五种母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe盐（100倍）、Ca盐（50倍）、有机物（100倍）。,63,3.激素母液的配制,64,生长素类、赤霉素类及脱落酸等用95乙醇溶解； 细胞分裂素类用1N HCl或1N NaOH溶解。通常激素母液浓度生长素类为0.10.5 mg/ml, 细胞分裂素母液浓度为0.21.0 mg/ml.,二、培养基的配制,水,药品,糖,琼脂,混合,加热溶解,调整pH,玻璃器皿,水洗,干燥,分装,灭菌,封口,冷却,接种,1、取出母液并按顺序放好。将洁净的各种玻璃器皿
12、如量筒、容量瓶、移液管、移液枪和玻璃棒等放在指定位置； 2、取一只容量瓶，放入配制培养基总量的1/3左右纯水，将母液按顺序加入，并不断搅拌； 3、加入植物生长调节剂后定容；,培养基的配制的具体步骤：,4、将定容的培养基倒入容器中，加入蔗糖和琼脂，并加热使其完全溶解； 5、调整pH； 6、将培养基分装倒培养器皿中，封好瓶口； 7、灭菌，用高压锅灭菌（121，1520min）或过滤除菌； 8、灭菌后待高压锅温度下降到50以下时，便可以取出、冷却凝固后待用。,68,69,三、培养基的保存,配制好的培养基一般要在室温、黑暗且清洁的地方放置35天再使用。保存时间太久，培养基可能会污染、脱水、易分解的成分
13、会发生分解，培养基成分会发生较大的变化。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。,四、培养条件,71,温度光照湿度气体培养基的渗透压pH值,植物材料一般最适温度在252之间,环境条件,光强： 10006000 lx,一般情况下，培养器内相对湿度应达100%，培养室内环境的相对湿度在70%80%,氧气是愈伤组织生长所必需的,调节渗透压常常从糖入手,植物组织培养时培养基的pH值大多在5.06.5,光质：影响细胞分裂和器官分化,光周期：光照16h，黑暗8h,第三节 基本操作,一、洗涤,1、玻璃器皿洗涤,新购置玻璃器皿,1%稀HCl,浸渍12h,洗衣粉洗涤,清水冲洗,晾干备用,已用过的玻
14、璃器皿,2、塑料用品洗涤,塑料器皿,2%NaOH浸泡12h,清水冲洗,2%5%盐酸浸泡30min,清水冲洗,蒸馏水冲洗,晾干备用,73,3、金属用品洗涤,热洗衣粉水洗净,冲洗,擦干,74,75,1.灭菌方法： （1）物理方法：物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等（2）化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌,75,二、消毒灭菌,2、灭菌,（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法压力在9.810410.8104Pa温度在121灭菌2030min（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌干热消毒灭菌,76,饱和蒸汽压力与其对应的温度,77,（3）塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌（4）金属用具灭
15、菌：灼烧灭菌浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用,（5）过滤灭菌：一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素。,78,（6）接种室灭菌,空气消毒灭菌,接种室,超净工作台,紫外灯照射,70%75%的酒精擦洗,培养材料的接种,紫外灯照射,79,（7）外植体灭菌,流水冲洗1020min或更长时间,70%75%酒精中浸泡30s,0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右,蒸馏水冲洗45次,在10%的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右,备用,80,常用消毒剂消毒灭菌比较表,81,82,熏蒸灭菌 常用熏蒸剂是甲醛。熏蒸时，房间关闭紧密，按68ml/m3用量，将甲醛置于广口容器中
16、，加克高锰酸钾促进挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。,82,（8）培养室灭菌,三、无菌操作,实验员消毒,实验室、无菌台灭菌,实验器材的灭菌,无菌接种,消 毒,实验台卫生,培养室培养,83,1、消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。2、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。3、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。4、用70%75%的酒精擦拭工作台和双手。,84,5、用沾有70%75%酒精的纱布或脱脂棉擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。,85,9、取下接种器械，在火焰上消毒。10、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。11、接种结束后，清理和关闭超净工作台。,注意：操作期间应经常用70%75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。,86,87,88,
