1、铁皮石斛多糖与甘露糖检测规程铁皮石斛TiepishihuDENDROBII OFFICMALIS CAULIS本品为兰科植物铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimu-ra et M1go的干燥茎。11 月至翌年 3月采收，除去杂质，剪去部分须根，边加热边扭成螺旋形或弹簧状，烘干；或切成段，干燥或低温烘干，前者习称“铁皮枫斗”(耳环石斛)；后者习称“铁皮石斛” 。【性状】 铁皮枫斗 本品呈螺旋形或弹簧状.通常为 26 个旋纹，茎拉直后长3.58cm，直径 O.2O.4cm。表面黄绿色或略带金黄色，有细纵皱纹，节明显，节上有时可见残留的灰白色叶鞘；一端可见茎基部留下的短须根。
2、质坚实，易折断，断面平坦，灰白色至灰绿色，略角质状。气微，味淡，嚼之有黏性。铁皮石斛 本品呈圆柱形的段，长短不等。【鉴别】 (1)本品横切面：表皮细胞 1列，扁平，外壁及侧壁稍增厚、微木化，外被黄色角质层，有的外层可见无色的薄壁细胞组成的叶鞘层。基本薄壁组织细胞多角形，大小相似，其问散在多数维管束，略排成 45 圈，维管束外韧型，外围排列有厚壁的纤维束，有的外侧小型薄壁细胞中含有硅质块。含草酸钙针晶束的黏液细胞多见于近表皮处。(2)取本品粉末 1g，加甲醇 50m1，超声处理 30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用石油醚(6090)洗涤 2次，每次 20ml，弃去石油醚液，水液用
3、乙酸乙酯洗涤 2次，每次 20ml，弃去洗液，用水饱和的正丁醇振摇提取 2次，每次 20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇 1ml使溶解，作为供试品溶液。另取铁皮石斛对照药材 1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(附录B)试验，吸取上述两种溶液各 25l，分别点于同一聚酰胺薄膜上，使成条状，以乙醇-丁酮-乙酰丙酮-水(15：15：5：85)为展开剂，展开，取出，烘干，喷以三氯化铝试液，在 105烘约 3分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。【检查】 甘露糖与葡萄糖峰面积比 取葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含
4、50pg的溶液，作为对照品溶液。精密吸取 O.4m1，按含量测定甘露糖项下方法依法测定。供试品色谱中，甘露糖与葡萄糖的峰面积比应为 2.48.0。水分 不得过 12.O(附录 H 第一法)。总灰分 不得过 6.O(附录 K)。【浸出物】 照醇溶性浸出物测定法(附录 X A)项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，不得少于 6.5。【含量测定】 （一） 多糖 1.1试剂1.1.1 6%苯酚：先配置 80%苯酚：80g 苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加 20g水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。 再配置 5%苯酚： 取 73ml80%苯酚于容量瓶中，加水至48g（每次测定均需现配） ，测定的时候就用 5%的苯酚
5、来测！ 1.1.2 无水乙醇1.1.3 80%乙醇1.1.4 浓 硫 酸1.2设备：1.2.1 10ml具塞试管，试验前检查塞子的密封性，不得有泄漏，1.2.2 10至 15ml离心管，使管口离 离心液液面 1cm以上，以防离心液甩出。1.2.3 紫外一可见分光光度计1.2.4 冰箱与冰块1.2.5 粉碎机，耐酸薄手套。2.2对照品溶液的制备 2.2.1)取无水葡萄糖对照品 0.1g，精密称定，加水制成每 1m1含 100g 的溶液，即得。标准曲线的制备 精密量取对照品溶液 0ml、0.1ml、O.2ml、O.4ml、O.6m1、O.8ml，分别置 10ml具塞试管中（用前注意检查塞子的密封性
6、） ，各加水补至 1.0ml，精密加入 5苯酚溶液 1ml(临用配制)，摇匀，再精密加硫酸 5ml，摇匀，置沸水浴中加热 20分钟，取出，置冰浴中冷却 5分钟，以相应试剂为空白，照紫外一可见分光光度法(附录 V A)，在488nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。20130723曲线 y=0.0088x+0.1128，y 为浓度.ug；x 为吸光度。备注：1.检测液位浓稠硫酸样液，腐蚀性很强倒皿时一定小心不要弄到手上，最好带上合适的手套。2检测液为浓稠硫酸样液，且总体积只有 7ml（共 2皿） ，连续检测多个样品时，比色皿用水洗净，尽量甩干，再用少量待测液润洗，
7、待测样品放在冰水浴中，测一个拿一个。3.试 剂 添 加 顺 序 ： 样 品 -5%苯 酚 -浓 硫 酸 ， 不 可 颠 倒 ； 样 品 加 浓 硫 酸 前 要 摇匀 ， 加 之 后 也 要 摇 匀 ， 注 意 塞 子 密 封 ， 小 心 漏 液 。 4， 用 过 的 浓 硫 酸 中 会 有 炭 丝 ， 若 检测 液 中 黑 炭 丝 的 颜 色 有 扩 散 的 话 ， OD 值 会 升 高 ， 需 重 处 理 复 测 。2.2.2供试品溶液的制备 鲜茎 100g以上，剪成 2-3mm段，105鼓风烘干，过 40目筛分别装入样品袋（鲜茎少的话，烘干后用锤子锤碎） 称重，按筛上下重量比例取本品 共约
8、O.3g，精密称定，加水 200ml，加热回流 2小时，放冷，转移至 250ml量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液 2mI，置 15ml离心管中，精密加入无水乙醇 10ml，摇匀，冷藏 1小时，取出，离心(转速为每分钟 4000转)20 分钟，弃去上清液(必要时滤过，观察上清液是否有沉淀，若有再离心或过滤)，沉淀加 80乙醇洗涤 2次，每次 8ml，离心(转速为每分钟 4000转)20 分钟，弃去上清液，沉淀加 60-80度热水溶解，转移至 25ml量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。测定法 精密量取供试品溶液 1m1，置 10ml具塞试
9、管中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入 5苯酚溶液 1ml”起，依法测定吸光度 A，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量，计算，即得。多糖含量%=（A-0.1124）/0.0088*250*25/（2*m*1000000）*100 其中（A-0.1124）/0.0088 为检测液浓度ug，250*25/（2*m）样品稀释倍数，1000000 为单位换算系数 1g=1000000ug。本品按干燥品计算，含铁皮石斛多糖以无水葡萄糖(C 6H12O6)计，不得少于 25.O。二）甘露糖 照高效液相色谱法(附录 B)测定。2.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以
10、乙腈-O.02molL 的乙酸铵溶液(20：80)为流动相；检测波长为 250nm。理论板数按甘露糖峰计算应不低于。t000。2.2试剂2.2.1盐酸氨基葡萄糖内标溶液 12mg/ml2.2.2 PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液 O.5mol/L2.2.3盐酸溶液 O.3molL，3mol/L2.2.4氢氧化钠溶液 O.3molL，3mol/L2.3 校正因子测定 取盐酸氨基葡萄糖适量，精密称定，加水制成每 1ml含 12mg的溶液，作为内标溶液。另取甘露糖对照品约 10mg，精密称定，置 100ml量瓶中，精密加入内标溶液 1m1，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取 4
11、001，加 O.5m01/L的 PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液与 O.3molL 的氢氧化钠溶液各 4001，混匀，70水浴反应 100分钟。再加 O.3molL 的盐酸溶液 500l，混匀，用三氯甲烷洗涤 3次，每次 2ml，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液，注入液相色谱仪，测定，计算校正因子。测定法 取本品粉末(过三号筛)约 O.12g，精密称定，置索氏提取器中，加 80乙醇适量，加热回流提取 4小时，弃去乙醇液，药渣挥干乙醇，滤纸筒拆开置于烧杯中，加水100ml，再精密加入内标溶液 2ml，煎煮 1小时并时时搅拌，放冷，加水补至约 100ml，混匀，离心，吸取上清
12、液 1ml，置安瓿瓶或顶空瓶中，加 3.Omol/L的盐酸溶液 O.5ml，封口，混匀，110水解 1小时，放冷，用 3.OmolL 的氢氧化钠溶液 0.5ml调节 pH值至中性，吸取 400l，照校正因子测定方法，自“加 O.5molL 的 PMP甲醇溶液”起，依法操作，取上清液 101，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含甘露糖(C 6H1206)应为 13.O38.O。【性味与归经】 甘，微寒。归胃、肾经。【功能与主治】 益胃生津，滋阴清热。用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少于呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软。【用法与用量】 612g。【贮藏】 置通风干燥处，防潮。
