1、 2009 PerkinElmer 酶标仪检测原理及应用 July-11- 2013 李军辉 2 酶标仪的应用 Agglutination Apoptosis Bacterial adhesion Bacterial identification Blue fluorescent protein BRET2 Cell adhesion Cell counting Cell expression Cell membrane integrity and lysis Cell proliferation Cell viability and cytotoxicity Chemotaxis Chlor
2、ophyll Colorimetric assays Cytokine analysis Cytotoxicity DELFIA, preferably bRDU assay DNA hybridization DNA quantification (fluorescence and UV absorbance) ELISA/FELISA Endocrine hormones Enzyme activity Enzymatic cleavage Enzyme kinetics Gene expression Environmental toxins FIA Gene expression Gr
3、een fluorescent protein GFP HTS Homogeneous TRF (LANCE) Immunoassays Intracellular Ca2+ measurement, Fura-2, dual-label ratiometric and kinetic Kinase activity LANCE Macrophage activity Metabolic activity MIC (minimum inhibitory concentration) Mitochondrial membrane potential Multiprobe assays NADH,
4、 NADPH Na+/H+ exchange NK cell activity Nucleic acid quantification Oxidative burst Oxidation reactions PCR product (quantitative and qualitative) pH indicators Phagocytosis Phospholipid assay PKU Protease activity Protein assays quantification Receptor binding studies Reporter gene Reverse transcri
5、ptase RNA hybridization RNA quantification Signal transduction SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) Steroid hormones Toxicology Uranium 3 技术原理 光吸收 化学发光 荧光强度 荧光偏振 时间分辨荧光 Alpha技术 Label-free技术 4 光吸收 物质对光的吸收 比耳定律 A=KCL K：吸收系数； C：物质的浓度； L：溶液光径长度 物质浓度测定 DNA： 260 nm Protein： 280 nm BCA： 562 nm Elisa： 450
6、nm MTT： 490 nm NADH： 340 nm Bacteria: 600 nm Plate： Clear Chlorophyll: K=105 cm-1M-1 BSA: 6.67 cm-1M-1 IgG: 14 cm-1M-1 5 荧光 能量由光辐射提供激发 : 物理激发 E=h=hc/ h：普朗克常量 ：频率 c：光速 ：波长 E发射 激发 荧光素 发射 =535 nm荧光素 激发 =485 nm Plate: Black Guess? Niels Bohr Max Plank 6 荧光应用 Ca2+ 测定 ： Fura-2， Fluo-3 DNA定量 ： Pico Green R
7、NA定量： Ribo Green GUS报告基因： 细胞增殖 ： Alamar Blue 细胞凋亡： Caspase-3 Ac-DEVD AMC 7 化学发光 能量由化学反应提供激发 ：化学 激发 A+B=C* 常消耗高键能物质如 ATP 闪光性（ flash）、辉光型（ glow） Plate： White C+light 8 化学发光应用 : Chemistry 9 化学发光应用 ： Luciferase 10 化学发光应用 ： ATP-Cell viability 11 化学发光应用 ： ATP-Kinase assay 12 化学发光应用 ： Luciferin-P450 (ADME)
8、 13 时间分辨荧光 ： “剩 ”者为王 镧系元素： Eu、 Sm、 Tb、 Dy Double L Long half-life： 可达 ms Large Stokes shift Eu 320 615 Sm 320 642 Tb 320 545 Dy 320 572 Prompt signal 立即检测的信号 Time resolved signal 时间延迟后的信号 Double D Delay Decay 14 时间分辨荧光应用 EuEuEuEuCell culture (1 5 days, +37C) BrdU Labeling (2 24 h, +37C) Remove label
9、ing medium (suspension cells have to be centrifuged) Cell fixation and denaturation (30 min, RT) Eu-Anti-BrdU incubation (30 120 min, RT) Wash 4 times Measure TR-fluorescence Add DELFIA Inducer and incubate 15 min DELFIA Proliferation protocol p p Eu Ex340nm Em615nm +Enhancement DELFIA HRP p p TMB +
10、H2SO4 OD 405 nm ELISA 1.0 1.4 1.7 2.2 3.3 4.2 7.2 8.0 3 13 19 41 56 74 93 83 0 20 40 60 80 100 Enzyme Concentration (units/ml) Signalto BackgroundELISA DELFIA Another useful reference for DELFIA kinase assay: Gaarde WA, etc., “Development of a Nonradioactive, Time-Resolved Fluorescence Assay for th
11、e Measurement of Jun N-terminal Kinase Activity J Biomol Screen 1997 Aug 2:4 213-23 An attractive alternative to Elisa 17 时间分辨荧光应用 TruPoint Cell cycle Tumor HIV-protease Caspase Osteoporosis HCV-protease Telaprevir Boceprevir 18 Alpha技术 : AlphaScreen AlphaLISA 20 节省资金 降低对样品用量的要求 无需稀释 缩短工作时间 缩短发表时间 减
12、少样品制备时间 简单到复杂的生物学相互作用 血清和血浆来源 AlphaLISA优点 100 1,000 10,000 100,000 1,000,000 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 ScaledunitsLog TNFa(g/mL) ELISA ELAST DELFIA AlphaLISA 灵敏度高 动态范围宽 均相性技术 亲近性检测 21 AlphaLISA vs ELISA 22 Biologics Angiogenesis Cancer Cardio-vascular Inflammation Metabolic Neuro- degeneration IgG CH
13、O-P NSO-P TNF alpha VEGF EPO VEGFB VEGFC VEGFD EGF-R EPO PSA TNF alpha AFP EPO-R ERBB2 / HER2 MMP1 MMP9 b-NGF EPO Myeloperoxidase NT-proBNP Plasminogen Renin tPA COMP G-CSF GM-CSF IFN gamma IL10 IL17 IL1 IL2 IL3 IL6 IL8 TNF alpha CRP IL1 IL12 (p70) IL13 IL18 CCL2 / MCP1 Adiponectin GH GLP-1 Insulin Leptin Prolactin IGF1 IGF2 A 1-40 A 1-42 sAPP sAPP Red = NEW kits AlphaLISA Immunoassay Kits Virology HIV p24 23 AlphaLISA-Life is totally different! 24 总结 物质对应单波长 样品自身发光 激发与发射双波长 结合值高，离散值低 延迟检测，降低背景 替代 Elisa Label-free 折射率反应结合
