1、层析分离法,特点： （1） 纯化倍数高 （2） 操作规模小，放大困难 （3） 终产品纯化 （4） 适用于价格昂贵的产品,色谱法(chromatography)以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法。,色层分离法基本原理,色层分离法基本原理,分子筛层析示意图,t0,层析的发展史,分类,按溶质分子与固定相相互作用机理 吸附层析：离子交换色谱 疏水作用层析 金属螯合色谱 共价作用色谱 分配层析 凝胶过滤 亲和层析,按实验技术分类 低压（小于0.5 Mpa) 中压 (0.5-5 Mpa) 高压 (5-40 Mpa) 电泳 (溶质在
2、电场中移动）,根据固定相形状分类 柱层析、纸层析、薄层层析根据流动相分类 气相层析、液相层析、超临界流体层析,分析色谱（10mg） 半制备色谱(10-50mg) 制备色谱(0.1-1g) 工业生产规模色谱(20g/d),按制备规格,基本概念,分配系数； 解离常数；分离因素； 阻滞因子；溶出体积 ； 分辨率 ；溶量因子,基本概念,（1）分配系数：溶质在固定相与流动相浓度比值 （2）解离常数：有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与 溶质在固相中的浓度比值 （3）分离因素：某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数(4) 阻滞因子：分配层析溶质移动速度（距离）与流动相移动速度（距离）比值,(5) 洗脱（容积
3、）溶出体积 ：在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相体积(6) 分辨率 ：两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比(7) 溶量因子：固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比,色谱体系中样品运行特点,不同组分的差速迁移(differential migration):混合物各组分在两相分配系数不同，分配系数大的迁移速度慢，使同时进入色谱柱的各组分得以分离。 同种组分的分子分布离散(sepreading)：入口处组分分布在一狭窄区带内，随着分子在柱内迁移，分布区带不断展宽，同组分分子迁移速度出现差异，主要是因为流体分子运动的速率差异造成，不是平衡分布不同引起。,层析介质,要求： （1）不溶于流动
4、相 （2）化学稳定 （3）机械强度 （4）大的表面积 （5）粒度均匀 种类： 无机（氧化铝，硅胶，活性碳）有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺）,氧化铝：多孔，微孔表面具有吸附性能比表面积大分子简单，空间形态复杂（8种以上）吸附量与含水量关系很大,制备：氢氧化铝加热脱水吸附基团：铝离子种类：碱性；酸性；中性应用：有机溶剂中分离天然成分,硅胶,硅胶：多聚硅酸分子间脱水形成 （1）化学组成 SiO2.XH20（2）无定形结构（3）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面,分类 特细孔硅胶 (0.8nm以下)细孔硅胶（1.52.0nm )中孔硅胶 (4.0一5.0nm)粗孔硅胶 (10.nm以
5、上)应用：优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物,琼脂糖,由海洋生物琼脂提取得到的主要成分 中性不带电 水溶性线状多糖 高亲水性，含大量羟基 能制成多孔性凝胶，分离大分子,制备： （1）去除带电琼胶成分 （2）将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化等方法制得珠状介质。 （3）采用交联剂增加介质的机械强度,商品种类 Sepharose 2B分离范围:70,000-40 106 , Sepharose 4B分离范围：60,000-20 106 , Sepharose 6B分离范围（球蛋白）：10000-410 6 颗粒大小：40-165um:最高流速14cm/h 。,经过交联而增加机械强度的琼脂糖 Sepha
6、rose CL-2B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B 应用 ：水溶液中分离蛋白质,葡聚糖,-1,6 相连的G聚合物，环氧氯丙烷交联 性质： （1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多） （2）化学稳定性及热稳定性好 （3）孔度与机械强度与交联度有关 （4）用于凝胶过滤 应用：水溶液中分离蛋白质等,纤维素,-1,4 相连的D-G线性天然高聚物 （1）亲水 （2）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度应用：离子交换分离蛋白质介质,聚丙烯酰胺,性质：（1）丙烯酰胺与交联剂N, N-甲叉双丙烯酰胺共聚（2）控制交联剂比例可控制网格孔度（3）亲水性不如多糖介质（4）机械强度差 应用：
7、凝胶过滤，电泳,层析装置与操作,泵 混合器 层析柱 检测器 记录仪 分部收集器,装置,柱层析分离法的有关装置,柱操作 （1）装柱 （2）平衡 （3）上样 （4）洗涤 （5）洗脱 （6）清洗 （7）再生,层析材料的准备: 装柱前用溶剂平衡凝胶层析材料：溶胀吸附剂：加热或酸处理离子交换剂：酸碱处理,在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。,装柱,调糊：50%（缓冲液介质） 一次连续加入悬胶液，避免分层 打开出口阀：层析剂沉降 排除空气：沿着玻棒倾注 检查均匀度,关闭出口用溶剂灌注至13体 积加浆状物放出过多溶剂如二次填装，应先在已经沉淀
8、的表面用玻棒搅拌后再倾注。,用溶剂彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。,上样,样品处理： (1）溶解 A 调整浓度：减少样品溶液体积，使区带狭窄 B 盐 C pH (2) 过滤：除去不溶物 流速：根据样品浓度与吸附速度而定 上样量：80%吸附容量,淋洗（去除残留在介质中的杂质）,盐浓度 pH 表面活性剂（0.1-0.5%) 淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定 防止产物丢失又要除去杂质,洗脱方法,按操作方式 a 恒定洗脱 (isocratic elution) b 分步洗脱 (stage elution)c 梯度洗脱 (gradient elution)逐渐改变溶剂的性质，形成一个离
9、子强度、pH或极性的递增梯度从而使各组分依次被洗脱优点：减少拖尾现象,按洗脱机理 专一性洗脱（specific elution） 非专一性洗脱（nonspecific elution） 添加剂：乙二醇, NaCNS 、脲素、盐酸胍 洗脱体积：5倍床体积,恒定洗脱,分步洗脱,梯度洗脱,部分收集 部分收集器：使每管按预定时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。每一部分的蛋白质或核酸的含量可以让流出液通过一个流动小室测定其280 nm或260 nm的光吸收来进行连续监测。,清洗与再生,弱酸：HAC 碱：氨水 促溶剂：1-3M KCNS， 6-8 M 尿素，6 M盐酸胍 极性溶剂：20%
10、 乙醇 表面活性剂 缓冲液平衡,亲和层析,亲和层析：利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法。(1) 酶底物或抑制剂 (2) 抗原抗体。 (3) 激素受体。 (4) 糖蛋白与凝集素, (5) 生物素生物素结合蛋白等,基质活化方法与配基偶联,活化: 基质（matrix）上的化学基团是不活泼的,无法与配基直接偶联,通过化学反应使介质上化学基团处于活化状态。 (1) 大分子配基可与活化基质直接偶联。 (2) 小分子配基, 在基质上接若干C原子手臂(spacer),然后再与配基偶联。 (3) 环氧氯丙烷, 1,4丁二醇缩水甘油醚本身是活化剂亦具有手臂作用。,活化方法,A 溴化氰法碱性条
11、件，与多糖上的-OH反应导入氰酯键或亚氨碳酸酯优点:（1） 适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质（2） 用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联（3）操作步骤简单,重现性好。（4）偶联条件温和,缺点： （1）形成的异脲键易产生非特异性吸附（2）不稳定,配基易脱落（3）活化操作危险性大，反应后的残余液需经处理再排放,溴化氰活化与配基偶联化学反应式,B 环氧氯丙烷 （1）形成的共价键稳定,配基不易落脱 （2）自动引入手臂 （3）有更小的非特异性吸附, （4）活化操作简单易行,危险性相对较小 缺点：强碱性条件反应。,环氧氯丙烷活化反应式,环氧基的氨化及偶联配基反应,C 对甲苯磺酰氯活化 （1）用
12、于含羟基基质,将羟基转化为磺酰基, （2）形成稳定化学键。 （3）在无水丙酮环境中进行。偶联配基在有机相或水相中进行,对甲苯磺酰氯活化反应式,手臂（spacer),作用 ：减少亲和作用空间位阻 手臂化合物：乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2已二胺 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH26-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH环氧氯丙烷 1，4- 丁二醇缩水甘油醚,残余电荷的掩蔽,目的：防止产生非特异性吸附 原理：通过化学反应消除基团上的电荷 方法：氨基：醋酸酐羧基：水溶性碳二亚胺,手臂氨末端的掩蔽,残留羧基掩蔽反应,活化基团与配基密度测定,方法： （1）氨基或羧
13、基可用酸碱滴定。 （2）有紫外吸收特征的,可用紫外分光法测定。 （3）通过测定反应余液中配基残留量推算（偶联率较高的情况） （4）某些情况下需将亲和胶样品分解破坏测定,疏水层析,将疏水性基团如丁烷、辛烷、苯固定化到介质上, 这些基团会与蛋白质生物大分子上的疏水区亲和 介质配基密度:4080mol/ml胶, 吸附容量：牛血清蛋白(BSA)大于40mg/ml,疏水层析介质制备过程示意图,羰基二咪唑,工艺条件,吸附： (1) 盐浓度：12M (NH4)2SO4 或NaCl (2) pH: 中性或偏酸性 淋洗：0.52%表面活性剂 洗脱: (1) 0.10.5M NaCl (2) 低浓度促溶剂,0.1
14、0.5 %NaSCN, 或2040%乙二醇,固定化金属离子亲和层析,层析剂：琼脂糖环氧活化的琼脂糖 双羧甲基氨基琼脂糖稳定的吸附中心 吸附机理：金属螯合介质能结合咪唑基及巯基,Cu2+, Zn2+， Ni2+,工艺条件,吸附： (1) pH 中性 (2) 低盐 (3) 金属离子 洗脱： (1) 降低pH (2) 提高盐浓度 (3) 缓冲液中加入螯合剂EDTA,共价层析,层析剂的二硫键与巯基化合物结合,(a) 谷胱甘肽二硫键层析剂 （b） 巯丙基型二硫键层析剂,谷胱甘肽巯基转移酶（GST）共价层析,（1） 将GST基因结合到目标蛋白基因上制成 表达融合蛋白 （2）用谷胱甘肽亲和介质吸附GST目标
15、蛋白 （3）用酶切除GST，得到纯化目标蛋白,苯硼酸共价层析,硼原子可与邻二羟基结构的糖形成共价五元环 吸附： （1）pH 8-9 （2）高盐促进苯基吸附 洗脱： pH 3-4, Tris缓冲液，甘露醇 应用：糖蛋白，核苷酸，多糖,蛋白质的离子交换层析,层析介质：纤维素 吸附条件：(1) 缓冲液pH(2) 蛋白浓度控制 （5mg/ml)(3) 离子强度,上样量：1-5%，高径比20:1, L:100cm(恒定洗胶）； 5-10%, 高径比5：1,L:20-40cm,（分步或梯度） pH 梯度：a 缓冲量大；b 离子强度变化；c pH 变化大,染料亲和层析,活性染料常含有一个或多个氨基或磺酸基。
16、其结构类似某些酶的底物（ NAD 中ADP核酸的结构类似物 ） 特点: (1) 蛋白结合容量大,是天然配基的10100倍 (2) 廉价易得。 (3) 普遍适用。 (4) 配基偶联方法简单,易于操作,可大规模应用。 (5) 染料的光谱特征可用来检测柱中染料浓度。 (6) 蛋白质洗脱容易， (7) 染料配基有可能脱落而残留到产品中。,机理,（1） NAD 中ADP核酸的结构类似物 （2）离子交换（磺酸基，氨基） （3）疏水作用（芳香基团） （4）金属离子，染料和蛋白质之间形成三元络合物,工艺条件,吸附： （1） 低PH （2）配体浓度 调整染料配体的浓度可以改变纯化因子 洗脱 （1）洗脱方式 ：分
17、段、梯度 （2）洗脱剂的选择 ： 磷酸盐、辅酶和核苷酸、底物、多元醇、表面活性剂及pH等,应用,染料的选择 Cibacron B1ue F3GA(CB)染料可用来纯化NAD依赖的脱氢酶: a核苷酸依赖的脱氢酶， b各种激酶，包括水解酶，乙酰基转移酶，磷酸水解转移酶，RNA和DNA核酸酶和限制性核酸内切酶等， c肌球蛋白，各种血蛋白及干扰素等 Procion Red HE3B，适于纯化对NADP依赖的脱氢酶则更有亲和性,凝胶层析法（Gel Filtration Chromatography）,又称凝胶排阻层析, 分子筛层析法, 凝胶过滤法等。 根据溶质分子大小进行分离。 （1）操作方便,不会使物
18、质变性。 （2）层析介质不需再生,可反复便用 （3）容量比较低 （4）一般在最后的处理中被使用。,吸附20mM, PH 7.0 磷酸缓冲液 洗脱：含盐缓冲液、 洗脱液进一步用凝胶层析 回收率45%,葡聚糖凝胶(Sephadex)的理化性质,(1) 排阻极限 (exclusion limit) 是指不能扩散到凝胶基质内部中去的最小分子的分子量 (2) 分级范围 (Fractionation range) 它指出了当溶液通过凝胶柱时,能够为介质阻滞并且分离的溶质分子量范围 (Sephadex G50, 它的分级范围为150030000) (3) 吸水量 (Water regains) 1g干凝胶所
19、吸收的水分称为吸水量。G-50的吸水量为5.00.3g,(4) 凝胶粒径 凝胶颗粒一般为球形 100-200目(50-150m) (5) 床体积 (Bed volume ) 表示1g干胶在溶胀后所具有的最后体积 (G-50的床体积为911ml/g 干凝胶 ) (6) 空隙体积 (Void volume) 表示填充柱中凝胶粒子周围的总空间(蓝色葡聚糖测出),操作,A. 凝胶选择：选型：脱盐： G-10, G-15, G-25，分级：G-50 ，G-100， G-150粒度：分粗(相当于50目), 中(100目), 细(200目), 极细(300目)四种粗, 中用于生产。 溶胀:干燥凝胶加水或缓冲
20、液在烧杯浸泡吸水,静置 ，筛选。,B 装柱 (1) 柱长：细长柱，脱盐：柱高50cm分级:100cm。 (2) 装柱: 均匀性:a 蓝色葡聚糖T2000溶液过柱，色带均匀下降。B 对光检查,C 加样 (1) 除去不溶物 (2) 样品浓度：大 (3) 上样体积：分析1-2%床体积;制备20-30% (4) 样品自然流进凝胶后，加洗脱液，防止返混,D 洗脱 (1) 洗脱液：洗脱液成份应与膨胀胶所用的液体相同 (2) 操作压：Sephadex G-100，2.49.4kPa, 而G200凝胶则为0.40.6kPa。 (3) 洗脱液分步收集,E 凝胶再生和保养 (1) 多次使用后重新填装。 (2) 短
21、期不用,加0.02%叠氮化钠(NaN3) (3) 长期不用, 酒精浸泡脱水需然后6080烘干。 (4) 离子交换葡聚糖凝胶：阴离子凝胶0.5mol/L HCl 溶液 水洗 0.5mol/L NaOH 水洗。阳离子凝胶处理次序相反。,应用,（1）脱盐 （2）分级分离 （3）分子量测定,电泳( electrophoresis ),特点： （1）分辩率高 （2）电场作用 （3）多用于分析,电泳,电泳(electrophoresis): 在电场作用下，带电颗粒在溶液中的运动。,理论基础,迁移率：单位电场强度下，粒子的泳动速度 影响电泳迁移率的因素 (1) 颗粒性质 (2) 电场强度 (3) 溶液的性质a 溶液的pH b 离子强度(0.05- 0.1M) c 溶液的粘度,凝胶电泳,利用分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离。 凝胶电泳与凝胶过滤的区别： 凝胶电泳：小分子快于大分子 凝胶过滤：大分子运动快于小分子 凝胶电泳中,系统里没有空隙体积,只有网状骨架。大分子物质不及小分子物质容易移动。,操作,(1) 配制试剂 (2) 制胶 (3) 聚合 (4) 样品处理 (5) 电泳 (6) 染色 (7) 脱色 (8) 扫描 (9) 保存,
