1、第十二章 分子发光分析法,12-1 分子发光分析概述,分子发光分析法：是基于被测物质的基态分子吸收能量被激发到较高电子能态后，在返回基态过程中，以发射辐射方式释放能量，通过测量辐射光强度，对被测物质进行定量测定的分析方法。光致发光：分子吸收光能被激发到较高能态，返回基态时发射出波长与激发发波长相同或不同的辐射现象。（荧光，磷光）,分子受光能激发后，由第一电子激发单重态跃迁回基态的任一振动能级时所发出的光辐射，称为分子荧光。激发态分子从第一电子激发三重态跃 迁回基态所发出的光辐射，称为磷光。由测量荧光强度或磷光强度建立起来的分析方法称为分子荧光或磷光分析。,化学反应过程中，分子吸收反应释放出的化
2、学能而产生激发态物质，当回到基态时发出光辐射，这种分子受化学能激发后产生的发光现象称为化学发光。利用化学发光现象建立的分析方法称为化学发光分析。,12-2 荧光与磷光分析基本原理,分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态基态：多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、电子激发单重态 S1 、S2 ；第一、第二、电子激发三重态 T1 、 T2 ；,1. 荧光和磷光的产生,电子激发态多重度：M=2s+1，s为电子自旋量子数代数和，只能为0
3、或1.若分子中全部轨道电子自旋配对，s=0，M=1，单重（线）态，S 若电子在跃 迁过程中不发生自旋方向改变，则分子处于激发的单重态， 若电子在跃迁过程中伴随自旋方向改变，则分子具有两个自旋不配对电子，s=1，M=3，分子处于三重态，T 三重态能级总比相对应的单重态能级略低。,室温下，大多数分子处于基态（S0）的最低能级（v=0），电子自旋配对，处于单重态。 当吸收一定频率的光辐射发生能级跃迁，到不同激发态各振动能级，大部分分子至第一激发单重态，这一过程称为激发，需要约10-15s 激发态分子不稳定，可通过辐射跃 迁或非辐射跃 迁等去活化过程回到基态，其中以速率最快，激发态寿命最短的途径占优势
4、。,常见去活化过程,振动驰豫：荧光和磷光分析学在溶液中进行，且溶液的浓度很低，因此，溶质与溶剂间碰撞概率很大，溶质的激发态分子可能将过剩能量以热能方式传递给周围溶剂分子，而自身从激发态的高振动能级失活，跃 迁到同一激发态的最低振动能级，这一过程称为振动驰豫。失活过程需要10-14-10-12s,内转换：指同一多重态的两个电子能态间的非辐射跃 迁过程，即，激发态分子将激发能转变为热能下降到低能级的激发态或基态。如：S1S0， T2 T1 此过程速率取决于涉及此过程的两能级间的能量差，当能级靠近或其振动能级有重叠时，内转换就极易发生。 S2以上激发单重态之间的内转换一常需要10-13-10-11s
5、,系间窜越（系间交叉）：指不同多重态的两个电子能态之间的非辐射跃 迁过程。 不同多重态间的跃迁涉及电子自旋状态的改变，如：S1T1，这种跃迁是禁阻的。 但若两电子能态的振动能级间有较大重叠，则可通过自旋-轨道偶合等作用使S1能态转入T1能态。因系间窜越是阻禁的，因而去活化速率非常小，需要10-6-10-2s,外转换：溶液中的激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子间相互碰撞失去能量，并以热能形式释放。外转换常发生在第一激发单重态或激发三重态的最低能级向基态转换的过程中。,荧光发射：若分子被激发到S2激发单重态的某一能级，处于此激发态的分子很快发生振动驰豫，下降到此单重态的最低振动能级，最后通过内转换
6、及振动驰豫过程，下降到S1激发单重态的最低振动能级。处于此最低振动能级的分子，可通过几种可能去活化过程回到基态： 在10-9-10-7s内发射光量子回到基态的各振动能级，这一过程 称为荧光发射。 以发生外转换的方式由激发态S1下降到基态S0 发生激发单重态到激发三重态T1的系间窜越。,磷光发射：发生从激发单重态S1至激发三重态T1的系间交叉后，分子通过快速的振动驰豫到达激发三重态的最低振动能级。当没有其它过程竞争时，在10-4-10 s内返回基态，并发射磷光。荧光和磷光的根本区别： 荧光是由单重-单重态跃迁产生， 磷光是三重-单重态跃迁产生的。,植物光合作用最初的反应中，包含叶绿素分子对光能的
7、吸收，吸收光能后分子处于激发状态，处于激发态的不稳定分子可通过多种途径，将多余的能量释放，使分子又回到稳定的基态，这些释放多余能量的过程，就是驰豫过程。,叶绿素分子吸收黄绿光时，分子处于较低激发态，蓝绿光 较高 较高能量激发态可将多余能量以热能释放，并降到较低能量激发态。,自旋轨道耦合越强，电子自旋方向越容易发生反转，S1T1的跃迁几率越大。顺磁性分子或具有较高原子序数的重原子都可影响单线激发态，使其发生系间交叉形成三重态。生物所含金属离子不同，会有不同的光辐射。 如： 卟啉化合物中心是镁离子或锌离子时，可发强烈的荧光。 叶绿素是含有镁离子的卟啉化合物。含铜离子、镍离子等顺磁性离子，往往发磷光
8、。,2、激发光谱和发射光谱,分子对光吸收具有选择性 不同波长的入射光具有不同的激发效率,固定荧光发射波长（测定波长），不断改变激发光（入射光）波长，以所测得此发射波长下荧光强度对激发光波长作图，得到荧光（磷光）化合物的激发光谱。若使激发光的强度和波长固定不变（常固定在最大激发波长处），测定不同发射波长下的荧光强度，即可得到发射光谱， 也称荧光（磷光）光谱。,荧光特性 荧光光谱： 用适合的波长做激发光照射样品（通常用它的吸收光谱的峰位波长），将得到的不同波长的荧光强度记录下来，以荧光强度为纵坐标，以荧光波长为横坐标，画出的曲线即为荧光光谱。荧光光谱及其峰位的波长总是比它的吸收光谱及其峰位波长要长
9、，这种现象称为光谱红移或Stokes位移。任何物质的荧光波长总比其吸收波长长， 因为荧光总发自于最低激发态的最低振动能级。 而激发往往使分子处于较高的激发态或较高的振动能级， 它们总要通过内转换释放多余能量，溶液荧光光谱中，荧光波长总是大于激发光的波长-荧光的第一个特征。,无论是叶绿素a 还是叶绿素b左边吸收光谱，右边是荧光光谱，两个光谱总有一个交叉点，通过此交叉点画一条垂直于横坐标直线，可看到左右两个光谱是镜像对称的发射光谱与吸收光谱呈镜像对称-荧光的第二个特征,任一物质的荧光光谱不决定激发光的波长但荧光强度与激发光波长有关。-荧光的第三个特征。,激发光谱说明哪种激发光波荧光效率最高。 该激
10、发光波长往往与该物质的吸收光谱中的峰位一致。 这就是为什么时常将一物质的荧光激发光谱代替其吸收光谱的原因。 从激发光谱的峰位波长可推测样品中是什么物质或基团吸收此波长而发荧光的。在简单体系中，一个发光团的吸收光谱与其荧光光谱是一致的。 其它情况下往往是平行或有些位移。,荧光光谱是生物学广泛应用的作用光谱或效应光谱的一个特例， 它们具有相同的测量和表示方法，只是把荧光换成其它要测量的结果。如：用不同波长的光照射蓝纱藻，测量它的放氧量（纵坐标）表示光合作用的大小， 得到的曲线就是光合作用的作用光谱（或效应光谱）。 它的峰位波长就表示该波长照射光合作用效率最高。,蓝绿藻细胞悬浮液的吸收光谱的峰位 与
11、光合作用的作用光谱一样， 而藻青蛋白的吸收光谱峰位 也与作用光谱一致， 说明： 照射的光是被蓝绿藻中的藻青蛋白吸收而进行光合作用的。,3、荧光效率 分子能发射荧光取决于两个条件：a、能吸收激发光，这要求分子具有一定的结构。b、 吸收与自身特征频率相同能量后，具有一定的荧光效率。 荧光效率也称荧光量子效率，表示物质发射荧光的能力，定义为物质发出荧光的光量子数 与吸收激发光的光量子数的比值,由于要测量绝对量子效率较困难，所以一般用相对法， 即：用一已知量子效率的物质为对照，应用上式加以比较,量子效率也可从激发态与驰豫过程的关系定义： 分子激发到S1激发态时，发荧光的那一部分与其它与荧光竞争的那些非
12、辐射过程及荧光过程的总和之比。,KF、Kic Kisc 分别表示荧光、内转换与系间交叉的速率常数。 K是上述不同驰豫过程的速度之和。荧光以外的过程可简化为：,4、荧光和分子结构的关系,（1） 具有共轭双键体系的分子： * 的荧光效率高，共轭双键结构有利于发光，共轭度越大，分子发光效率越高，且荧光光谱向长波方向移动。（2）具有刚性平面结构的分子：荧光量子效率高。,荧光素中氧桥使分子具有刚性平面，减少分子振动，减少系间窜越至三重态及碰撞去活的可能。,（3）取代基的影响：芳香化合物的芳香环上，给电子基团使荧光增强，吸电子基团减弱甚至猝灭荧光；卤素原子取代，原子序数越大，荧光越弱。双取代或多取代，若能
13、增加分子平面性，则荧光增强，反之则减弱。,5、荧光定量分析原理,（1）荧光强度和溶液浓度的关系（荧光定量关系式） 溶液荧光强度 If和该溶液的吸收光强度Ia及荧光效率成正比。 If= Ia根据Beer定律，溶液吸收光量 Ia=I0-It=I0（1-10-bc） If= I0（1-10-bc ）= I0 （1-e-2.3bc ） 当bc 小于0.02时，If= 2.3 I0bc 荧光定量关系式,荧光强度取决于仪器常数K，照射光强度I以及与吸收有关的因素A， 其中最重要的是样品浓度。样品浓度大，荧光就强。注意：是在一定范围内（10-4-10-7 mol/L） 浓度超过 10-3mol/L浓度越大荧
14、光越小，这叫浓度猝灭现象。,（2）环境对荧光强度的影响（自身、溶剂种类、温度、pH等。） 溶剂影响：溶剂极性大，常使荧光峰波长红移 温度影响：温度高，荧光效率和荧光强度低 溶液pH影响：荧光物质为弱碱或弱酸性时，受pH改变对荧光强度和光谱影响大。苯胺在pH7-13溶液中分子形式存在，发蓝色荧光，大于13或小于7以离子形式存在 ，不发荧光。 散射光影响：当激发光波长与荧光物质荧光峰波长相近或拉曼光谱较激发光长些时，瑞利散射和拉曼散射光可与荧光光谱重叠产生严重干扰。可以通过选择合适激发波长消除。因溶剂瑞利散射和拉曼散射随激发光波长改变而发生变化，而荧光波长与激发光波长无关。,5. 激发光照射的影响
15、： 荧光物质稀溶液可能在激发光照射下发生光分解，引起荧光强度急剧降低。 光分解作用：物质受到光线照射，所吸收的能量使分子内一个或几个键发生断裂，使该物质分解。 易发生光分解的荧光物质溶液测定，可采取强度较低激发光，或缩短测定等方式，以减少荧光物质分解引起的测量误差。,6、荧光猝灭：荧光物质与溶剂分子或其他溶质分子相互作用，引起荧光强度下降或消失的现象称为荧光猝灭。 能引起荧光猝灭的物质称为猝灭剂。碰撞猝灭：单重激发态的荧光分子与猝灭剂碰撞后，以无辐射跃迁返回基态，引起荧光强度下降。猝灭剂分子与荧光分子发生作用，形成配合物或发生电子转移反应，也会引起荧光猝灭。,溶剂效应结果常使荧光波长红移，移向
16、长波长。 许多极性分子的激发态比基态极性更大， 若增加溶剂介电常数，吸收和荧光就会移向较长波长。减小 短波长 若增加溶剂的非极性，荧光波长会蓝移。极性 红移。,溶质对荧光的影响是指溶质与溶质（发光团）的相互作用。 主要作用是引起荧光团荧光的猝灭。荧光猝灭是一广泛现象，包含各种不同发生机制。在没有溶质作用下，仅因为发光团浓度增加也会发生荧光的自身猝灭。这就是浓度猝灭。浓度猝灭是由于相同分子间的能量转移产生的。,溶质对荧光的猝灭效应多种多样，主要产生机制：能量转移、碰撞以及与发光团形成络合物。1. 荧光由于能量转移而产生的猝灭，是指溶质与荧光团之间的距离小于10nm，两者波长关系又符合在满足能量转
17、移所需要的条件时所产生能量非辐射共振转移。结果使原来被激发的荧光团转移能量给溶质分子，荧光团的荧光则猝灭或减弱。,2. 溶质与荧光团发生碰撞产生的荧光猝灭是最通常的一种猝灭。（也称动态猝灭） 这种猝灭是由于荧光团A与溶质Q发生碰撞，从而A将激发能转移给Q，A的荧光猝灭。这种溶质就叫猝灭剂。碰撞猝灭受扩散控制。当增加溶液的粘滞性或减少Q的浓度，猝灭效应就降低。 常用的猝灭剂有I、O2聚丙烯胺以及Cs+等的猝灭作用都是由碰撞产生， 氧的猝灭作用还因为它有顺磁性， 可加强荧光团从S1向T1的转化，从而猝灭荧光团的荧光。,3. 溶质与荧光团形成络合物，从而使荧光团的荧光猝灭，这种猝灭叫做静态猝灭。 静
18、态猝灭可减少激发分子的浓度，改变荧光强度，但不改变其寿命。,6、荧光定性分析 任何荧光（磷光）都具有特征光谱：激发光谱和发射光谱，这是荧光（磷光）定性分析的基础。物质分子结构不同，吸收的紫外光波长和发射波长具有有特征性，因此根据荧光物质激发光谱和发射光谱，可鉴别化合物。在相同的分析条件下，将待测物的荧光发射光谱与预期化合物的荧光发射光谱比较，如果发射光谱特征峰波长与形态一致，可认为可能为该物质。若发射光谱相似或重叠，可考察激发光谱。通过激发光谱与发射光谱结构进行鉴定，可提高定性分析可信度。,12-3 荧光与磷光分析仪,12-4 荧光分析法与磷光分析法的特点与应用,1、荧光和磷光分析法的特点：A
19、、灵敏度高：常比紫外-可见光光度法高2-4个数量级， 因为荧光或磷光分析法是在入射光直角方向测定荧光强度，即在黑背景下进行检测，可通过增加入射光强度或增大荧光或磷光信号放大倍数来提高灵敏度。而紫外可见分光光度法中测定的参数是吸光度，该值与入射光强度和透射光强度的比值有关，入射光强度增大，透射光强度也相应增大，增大检测器放大倍数也同时影响入射光和透射光的检测。从而限制了灵敏度的提高。,B、选择性好：优于紫外可见分光光度法 C、可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性 D、荧光分析法提供的信息丰富，能反映分子的各种特性。 E、荧光和磷光分析法测量简单，不足之处： 本身能发荧光或磷光的物质不多，增强荧光的
20、方法有限，因此作为常规试样的定量分析方法不及紫外-可见分光光度法应用广泛。,2、荧光分析法和磷光分析法的应用 （1）痕量分析 （2）可充当联用技术的检测器 （3）分子结构性能测定,荧光团与探针荧光团表示能被激发和发荧光的物质分子或基团。 一些生物大分子有一些本征的或内在的荧光团，如：蛋白质中的芳香氨基酸，tRNA中的Y碱基。还有许多生物分子本身是发荧光，如：维生素A、黄素、叶绿素、NADH等，这些是天然的荧光团。许多物质分子不发荧光，或许多大分子不含发光团，有时即使含有荧光团但达不到研究目的，因此常用一些能发荧光的物质，使其共价结合或标记在所在研究的分子或体系中的某一基团，利用它的荧光特性来提
21、供研究对象的信息，这些发荧光的物质分子就叫做外在荧光团，或称为探针。,荧光探针种类很多，可根据研究需要合成新探针。,一、基本原理 principle,1. 化学发光反应在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A +B = C + D*D* D + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物； （2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E=170300 kJ/mol；位于可见光区； （3）发光持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。,12-
22、5 化学发光分析,2.化学发光效率,化学效率：,发光效率：,时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：,dc/dt 分析物参加反应的速率；,3.化学发光强度与化学发光分析的依据,在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：,dc/dt =Kc；K 为反应速率常数。 定性依据： （1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；,（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：,4.化学发光反应的类型,（1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应 NO + O3 NO2*NO2* NO2 + h发射的光谱范围：600875nm，灵
23、敏度1ng/cm-3； b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应O3 O2 + O （1000 C石英管中进行）SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；,O3 O2 + O （1000 C石英管中进行）NO + O NO2*NO2 * NO2 + h发射光谱范围：4001400nm；灵敏度1ng/cm-3； 氧原子与CO的发光反应：CO + O CO2*CO2 * CO2 + h发射光谱范围：300500nm；灵敏度1ng/cm-3；,氧原子与NO的发光反应：,c. 乙烯与O3的发光反应,乙烯与O3反应，生成激发
24、态乙醛：,CH2O* CH2O + h最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1 ng/cm-3 1g/cm-3；,（2）火焰中的化学发光反应,在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应； a. 一氧化氮 NO + H HNO*HNO * HNO + h发射光谱范围：660770nm；最大发射波长：690nm；在富氢火焰中：NO2 + 2H NO + H2O 该反应十分迅速；,b.硫化物,挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：SO2 + 2H2 S + 2H2OS + S 2S2 *S2 * S2 + h发射光
25、谱范围：350460nm；最大发射波长：394nm；灵敏度： 0.2 ng/cm-3；发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。,（3）液相中的化学发光反应,机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.150. 05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：,该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：,5. 化学与生物发光分析的应用,（1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可
26、间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等 （2） 可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2； （3） 间接测定某些生物试样,氨基酸 + O2 酮酸 +NH3 + H2O2,氨基酸氧化酶,葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。,葡萄糖氧化酶,草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。,生物发光分析应用 1
27、,在pH 78；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：,ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP LH2 E +Mg ppi + 2H+,pH7 - 8,复合物与氧反应，产生化学发光：,AMP LH2 E + O2 氧化荧光素* + AMP+CO2 + H2O 氧化荧光素* 氧化荧光素 + h 最大发射波长562nm；,生物发光分析应用 2,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应 ：,NADH + FMA
28、+ H+ NAD+ + FMNH2,NADH脱氢酶,FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h,黄素酶,最大发射波长495 nm；,二、特点 characteristics,1. 灵敏度极高例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17。Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量 2. 仪器设备简单不需要光源、单色器和背景校正； 3. 发射光强度测量无干扰无背景光、散射光等干扰； 4. 线性范围宽 5. 分析速度快 缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。,三、装置与技术 instrument and technology,装置流程：,发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；,作业(17) 2、3、4、5、6、7,
