1、层析技术,第一节 层析概述,层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。,一、概况,1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。 1944年出现纸层析。以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲
2、和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。层析技术是一种分离技术，是混合物最有效的分离、分析方法。,经典色谱（offline),Tswett把植物绿叶的色素混合液加在一根装有干燥固体碳酸钙颗粒（称固定相）的玻璃长管（称为填充色谱柱）上端; 洗脱剂（亦称流动相）石油醚自上而下流过； 在石油醚不断冲洗下，原来在柱子上端的色素混合液向下移动。由于色素中各组分的性质的差异，最后分离成不同颜色的清晰色带； 将潮湿的碳酸钙挤出玻璃管，用刀将各色带切下，对其中的组分用合适的分析方法分别进行测定。
3、,现代色谱（online),当一个二组分（A和B）的混合样品在t1时间从柱头加入; 随着流动相不断加入，洗脱作用连续进行，直至A和B组分先后流出柱子而进入检测器; 从而使各组分浓度转变成电信号后记录在记录纸上，或显示在荧光屏上，或由电脑贮存后打印出来。,层析技术的原理,层析系统都由两个相组成：一是固定相(不动的一相)，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相(携带样品流过固定相的流动体)，即可以流动的物质，当待分离的混合物通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，与固定相相互作用力越弱的组份
4、，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。,二、层析法的特点,分离效率高：复杂混合物、有机同系物、异构体、手性异构体。 灵敏度高：可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。 分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 应用范围广 不足之处：被分离组分的定性较为困难。,层析应用范围,凡是溶于水和有机溶剂的分子和离子，在性质上有一定差异均可通过层析方法进行分离。分离的范围包括： 无机化合物：无机盐类、无机酸类、络合
5、物类等 有机化合物：烷烃类、有机酸和有机胺类、杂环类 生物大分子：核酸和核苷酸类、蛋白质、酶及肽类、多 糖及寡糖类、激素类 活体生物： 病毒、细菌、细胞器等,分析的参数,常见的层析分离法分析技术，是以混合物中分离单一成分，制备一定量的产品为主，以分析鉴定化合物的性质，获得分析参数为辅。 HPLC以分析为主。 通过层析方法可以对物质进行一定程度的定量、定性和纯度鉴定。,按层析原理分类（一）,按层析原理分类（二）,离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。,吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。,凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。
6、,按层析过程的机理分类,按两相所处状态分类,超临界分析：利用流动相溶剂分子的气态和液态临界点的条件下进行分离，更具专一性。,按操作形式不同分类,层析分类法,纸上层析是用滤纸作为支持剂（载体）的一种色层分析法，这种方法的基本原理一般认为主要是利用混和物中各组分在流动相和固定相间的分配比的不同而使之分离。 纸上层析可用于化学性质相近的混和物的分离，特别适宜于微量物质的分离和鉴别。而且使用的仪器简单，操作比较容易，重现性好。,三、层析前蛋白质处理,主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但
7、分辨率低。,1、盐析法,盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。,2、等电点沉淀,在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。,3、有机溶剂沉淀,降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间的静电引力，使蛋白质产生沉淀；有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生沉淀。,四、层析基本操作过程,上样均一性洗脱装置,目的不
8、同 检测方法不同 活性检测,基质均匀性 柱层析的L/d比值,1、柱层析的L/d比值,2、洗脱装置,不改变溶剂体系依靠液面的水位差产生的静压力致使洗脱液不断流经层析柱 缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。 改善：蠕动泵或恒流泵,维持流速恒定的简易装置,改变溶剂系统,分级洗脱在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。 缺点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密，同一个洗脱级组分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。,改变溶剂系统,梯度洗脱一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度沉
9、入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。 注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接近的蛋白质。,线性梯度洗脱装置,性能未知样品的蛋白质分离：改变缓慢的梯度洗脱若为单峰：分级洗脱,3、结果检测,活性检测比活没有提高 目的蛋白与杂蛋白并没有分开比活有所提高，但总活性回收很低目的蛋白有损失或有失活现象 测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性,结果保存薄层层析&纸层析照相保存or 扫描仪转为图形or 积分仪变成数据柱层析检测器、记录仪和积分仪处理,4、层析装置的仪器化,HPLC,与电脑、质谱等连用,伯乐公司duoflow中高压层析仪,安马
10、西亚公司akta高效快速层析仪,液相层析技术,概况,分离范围： 无机化合物 有机化合物 生物大分子 活体生物应用范围： 大规模生产 小型制备、微量分离 定性定量分析,液相层析仪,伯乐公司duoflow中高压层析仪,安马西亚公司AKTA高效快速层析仪,组份收集器,操作控制,动力系统,工作台,层析柱管,填充技术,介质的预处理：溶胀、漂洗、再生、转型、脱气等 湿法填充：搅拌悬浮，自然沉降。 填充质量,检测器,紫外检测器 荧光检测器 折光检测器 电导检测器,固定相,固定相是不溶于溶剂和水的固定化颗粒，又称为层析介质、层析填料、填充剂等。包括： 无机材料：硅胶，氧化铝 有机材料：聚苯乙烯等 多糖类材料：
11、葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺,层析介质与生物大分子的关系,大孔径的，亲水性好的球形材料。 多糖类凝胶层析介质最常用 Sephadex Sepharose Bio-Gel 缺点：刚性差，不耐压，分离时间长,层析介质的性能,层析介质的形状：球形，不定形 技术指标 粒度大小：粒度小，分离效果好，但流速慢 均匀度：均匀，流速快，峰值集中 机械强度：强度高，流速快，保留值小，柱效高 理化性质：稳定，非特异性吸附少，亲水性好，耐酸碱和有机溶剂 吸附容量：单位质量或体积的层析介质吸附流动相中溶质的质量。,流动相,流动相 缓冲溶液：根据待分离物质的性质（等电点、极性、溶解度、稳定性等）选择缓冲溶液及其浓度、pH
12、值、离子强度、缓冲容量等。 保护剂：抗氧化剂、稳定剂、蛋白酶抑制剂等有机溶剂：根据待检测物质的极性及溶解度来选择不同极性的溶剂。,第一节 吸附层析,吸附层析,定义：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中的各组分分离的方法。 原理：层析介质表面的吸附基团对溶质发生吸附作用，该基团对不同溶质的吸附能力的强弱有较大的差异，可根据这种差异性，将不同溶质进行分离。,原理,根据物料中各组分对固定相(吸附剂) 的吸附程度不同，以及其在相应的流动相(溶剂)中溶解度的差异来实现。经反复的吸附解吸再吸附再解吸的过程，达到分离目的。无化学键引入，只存在相对较弱的氢键力、范德华力和偶极力相互作用。吸附力的产生,
13、吸 附,吸附：任何两相都可以形成界面，其中一相的物质或溶解在其中的溶质在另一相表面上发生密集行为。吸附现象：溶质从溶液中到停留在固体表面上的现象，固-气、固-液、气-液。吸附介质：凡是能够将周围其他分子聚集到某一物质表面上的材料。被吸附物质：能够聚集在吸附介质表面的分子。,吸附种类,物理吸附：是依靠分子间相互作用的范德华力引起的吸附，非特异性吸附，吸附速度快，吸附力较强。 化学吸附：是依靠物质中的化学键的作用引起吸附，是选择性吸附，吸附速度慢，吸附力强，不易解吸。 复合吸附：是指物理和化学吸附同时发生。 饱和吸附：在单位时间内被吸附物在吸附介质某一表面积上的分子与同一单位时间内的该介质的同一表
14、面上解吸附的分子达到了动态平衡，处于该环境中吸附介质的吸附作用达到饱和。,吸附剂的选择,性能：表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉极性：羟基磷灰石，硅胶，氧化铝，人造沸石 非极性：活性炭,吸附剂,活性炭 硅胶 氧化铝 聚酰胺 羟基磷灰石,吸附介质的分类及其性质（一）,羟基磷灰石 特点：抗机械强度弱。 原理：溶质分子中的酸性基团与洗脱液中的磷酸根离子对羟基磷灰石中的钙离子有竞争作用。 应用：分离有序和无序的生物大分子，如分离RNA和DNA等。,吸附介质的分类及其性质（二）,硅胶：化学性质稳定、吸附量大。原理：颗粒表面存在的很多硅酰基作为活性中心与所进行层析的化合物形成强的氢键作用
15、。硅酰基能够通过氢键的形成而吸附水分，并随着吸着的水分增加而降低吸附力。 制备：一种多孔性物质,因-O-Si(-O-)-O-Si(-O-)-O-结合而具有三维结构,表面具有硅羟基,作吸附剂的硅胶需经加热处理,除掉其表面吸附水,使之活化。按其孔径分布分为表面多孔和全多孔两类。硅胶既是吸附色谱最常用的固定相，也是分配色谱、离子色谱等色谱固定相的常用基质。,硅 胶,影响表面积的因素：酸化时的pH絮凝的速度表面积大小硅胶吸附能力大小其吸附活性取决其含水量：1%时，吸附活性最高；20%时，吸附活性最低。 硅胶的分子内部的水分子，在活化时随着烘烤的温度升高，其活化的程度也不断提高，200-2500C加热活
16、化时，吸附力最佳。,活化加热至100110，除去硅胶表面因氢键所吸附的水分当温度升高至500-1000时，硅酰基脱水缩合转变为硅氧烷键，不再有吸附剂的性质再生: 提高其吸附能力。一般可用乙醇或甲醇洗涤，除去溶剂，110烘干活化处理,吸附介质的分类及其性质（三）,氧化铝：多孔的A1203的聚合物，吸附性能也可通过改变其含水量加以控制。性质：属于疏水性吸附介质。分离非极性化合物。 优点：吸附容量大，分离效果好，价格低。 缺点：具有催化性能。碱性条件下不稳定的化合物分离时容易发生诸如异构化、氧化和消除等次级反应 原理：被分离的物质与氧化铝表面的一些羟基形成氢键。,碱性氧化铝：氢氧化铝高温脱水。pH值
17、约为9.010.0，分离碳氢化合物及某些中性或碱性化合物。中性氧化铝：碱性氧化铝经一些列处理。pH约为7.5，分离醛、酮、醌类及核苷类化合物。酸性氧化铝 ：氧化铝经一系列处理。pH值约为4.0，分离酸性色素及醛酸类化合物。,种类及制备,活化200左右加温46小时再生弃去柱顶端的加样部位后，依次用甲醇、稀乙酸、稀氢氧化钠溶液和水洗涤，再经高温(200)活化,吸附介质的分类及其性质（四）,活性炭 原理：活性基团（-OH）与被分离的物质分子中的某些基团产生范德华引力形成吸附。 根据材料分：动物炭、植物炭、矿物炭 根据颗粒粗细分： 粉末活性炭：颗粒较细、吸附容量较大、常用于脱色 颗粒活性炭：粒度大、流
18、速快、吸附容量较小 锦纶黏合活性炭：吸附能力弱 应用 可分离水溶性芳香族化合物与脂肪族化合物、氨基酸与肽、单糖与多糖 目前，多用于在结晶过程中进行脱色和脱臭等操作中的简单吸附过程,活性炭,在不同的溶液或溶剂中的吸附能力是不同的 在水溶液中吸附能力最强，在有机溶剂中吸附能力较弱； 对极性化合物吸附能力较强，非极性的化合物吸附能力较弱； 在酸性环境中吸附能力强； 在水中对同系物的吸附量随着同系物的分子量的增大其吸附量而增加。,吸附介质的分类及其性质（五）,聚丙烯酰胺 特点：化学合成的一种极性吸附介质，适合于分离极性化合物，吸附特异性强，分辨率高，吸附容量大，选择性强，应用广。 原理：聚丙烯酰胺分子
19、中的酰胺基与被分离物质如酚类、酸类、醌类以及硝基化合物等之间的羟基和羧基形成不同强度的氢键结合而被吸附。 在水中形成氢键的能力大于在有机溶剂中 对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差 应用：生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等极性与非极性化合物的分离,吸附介质的分类及其性质（六）,聚苯乙烯 性质：非极性吸附介质，适于分离在分子中含有硝基、氯原子和酚羟基的化合物；吸附性强（具有较多的穿透孔）、刚性强、流速快、分辨率高。 原理：被分离物质分子中的疏水基团与聚苯乙烯之间形成范得华力。,吸附剂的选择,被分离物质的特性：极性吸附介质、非极性吸附介质。 介质的容量：选择比表面大、吸附容量大的吸附介质。 介质
20、的通用性：选择多功能的吸附介质。 介质的稳定性：理化性质稳定，不与溶剂、洗脱剂、样品等发生化学反应。 介质的刚性：选择刚性较强、颗粒度均匀的吸附介质。,上样剂和洗脱剂的选择,洗脱剂，上样剂：溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。 上样剂有利于吸附介质对溶质的吸附 洗脱剂对样品有强的解吸附能力,选择原则,纯度较高； 对样品有较好的溶解度（能较完全洗脱所分离的成分）和稳定性（不发生聚合、沉淀、变性和相关的化学反应） ； 粘度小； 易和所需要的成分分开。 对检测器不敏感（光谱检测器、电导检测器、pH检测器）。,分离过程-吸附过程,吸附过程选用有利于吸附的、洗脱能力弱的溶液作为流动相。 影响因素：吸附能力
21、的强弱与溶剂的性质、极性、黏度、离子强度、介质活化的程度、流速、吸附介质的种类、样品的性质等因素有关。 吸附量与吸附特异性的平衡协调。,分离过程洗脱过程,柱内的吸附介质与吸附溶质间不断发生吸附解吸附再吸附再解吸附的循环过程。 溶质在吸附介质上的吸附有强弱的差异，吸附强的溶质溶解速度慢，解吸附难，保留值大。 不同保留值大小的溶质在层析柱内的移动过程中产生了差异。 选择具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流动相，吸附能力强的吸附介质采用具有较强的洗脱能力的洗脱剂洗脱。 溶剂的极性大，洗脱能力强。 溶液的离子强度高，洗脱能力强。,色谱流出曲线及有关术语 流出曲线和色谱峰,在层析分离中,当流动相中的溶质分子流
22、过层析柱时,就会在固定相和流动相两相之间不断发生作用。 在前进的过程中由于被分离物质的性质不同导致其移动速度也不同,在柱内的滞留时间有差异。 当流动相中的各组分在两相中保留值不同时,它们在层析柱内迁移速度就会产生差异。,随着层析时间的延长组分与组分之间彼此分离开.最后分别收集各组分.以组分的保留时间为横坐标,吸光值为纵坐标作图,得到色谱峰。,基本术语,1. 基线柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，稳定的基线应该是一条水平直线。,h,Wb,Wb,Wb,Wb,h,Wb,h,Wb,h,Wb,色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，,2. 峰高,3、区域宽度,标准偏差 即0607倍峰高处色
23、谱峰宽。 峰宽Wb 自色谱峰两拐点处做切线与基线相交点，这两点的直线距离。 半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽,4. 死时间t0,不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间。与固定相填料的空隙体积成正比！,流动相中的溶质进入层析柱后,不被固定相所吸附,与固定相不发生任何作用,流过层析柱所收集的体积。包括柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F（Lmin）计算：V0 = t0F,5死体积 V0,6. 保留时间tR,试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经
24、历的时间，称为保留时间，它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间。,从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间tR的关系如下： VR = tRF0,7保留体积 VR,某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即 tR = tR-t0,8调整保留时间tR,某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即VR = VR- V0,9调整保留体积VR,某组份B的调整保留值与组份A的调整保留值之比，称为相对保留值。,必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比 .,10相对保留值KAB (柱选择因子),当出现2个以上的峰时，KAB就
25、是选择性，最早出现的峰为S峰，后面出现的某个峰为i峰。选择性主要决定于固定相性质，其次是色谱柱温度。值越大，表示固定相对组分的选择性越高，则两组分分离得越开。等于1时，两组分重叠。,= tR（i） / tR（S）=VR（i）/ VR（S）,KAB = tRB / tRA=VRB/ VRA,分配系数:在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的 浓度之比值 。 分配系数大的组分在固定相上的溶解或吸附能力强，因此在柱内的移动速度慢。反之，分配系数小的组分在固定相上的溶解或吸附能力弱，在柱内的移动速度快。 分配系数体现了不同组分的热力学性质的不同,其大小反映了组分在固定相上的溶解挥发
26、或 吸附解吸 的能力。,11. 分配系数K,K=cs / cm,cs 溶质在固定相的浓度 cm溶质在流动相的浓度,分配系数K的物理意义,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢； 试样一定时，K主要取决于固定相性质； 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出； 分配系数K与溶质和固定相的热力学性质有关，与两相的体积、层析柱的特性无关。,分配系数K与分离性能,K决定于组分和两相的热力学性质。在一定温度下，K小的组分在流动相中浓度大，先流出色谱柱；反之，后流出色谱柱。两
27、组分K值之比大，（不是指每一组分的K的绝对值越大），是获得良好色谱分离的关键。 分配系数与温度成反比，增加温度，分配系数变小。在气相色谱分离中，柱温是一个很重要的操作参数，温度的选择对分离影响很大，而对液相色谱分离的影响小。,12.分配比K (容量因子),分配比是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的总质量比。,1. 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。 2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。 分配比与分配系数的不同在于分配比不但与组分和两相性质有关，而且还
28、与两相体积有关,b,K,V,V,c,c,V,V,M,V,V,M,M,M,K,m,S,m,s,m,m,m,S,S,S,m,S,=,=,=,=,K=K,相对比率,色谱分析基本原理(1),色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。 但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以至彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。 因此,要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。,色谱分析基本原理（2）,色谱理论需要解决的问题：色谱
29、分离过程的热力学和动力学问题，影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。 组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制； 色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散） 两种色谱理论：都是以层析过程中分配系数为前提 塔板理论:对层析柱的质量的判断和选择有指导意义; 速率理论:对层析分离条件的选择具有指导意义.,塔板理论-柱分离效能指标,塔板理论（plate theory） 半经验理论：将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）。 该理论将一根色谱柱当
30、作一个精馏塔，其中的每一小段色谱柱相当于精馏塔中的一个塔板,从而描述组分在色谱柱内的分配行为。,把色谱柱比作精馏塔，视作由许许多多小段(塔板)组成,且塔板与塔板之间不连续;塔板之间无分子扩散。 组分在每块塔板的两相间的分配平衡瞬时达到，达到一次分配平衡所需的最小柱长称为理论塔板高度H。 一个组分在每块塔板上的分配系数相同。 流动相以不连续的形式加入，即以一个一个的塔板体积加入，连续的色谱过程视作一个塔板中的两相平衡过程的重复。 组分进入色谱柱后，在每块塔板上进行两相间的分配。塔板数越多，组分在柱内两相间达到分配平衡的次数也越多，柱效越高，分离就越好. 理论塔板数为:,塔板理论假定,理论塔板数,
31、由上式可知，组分的保留时间越长，峰宽度越小，则理论塔板数n越多，色谱柱效能越高。,有效塔板数和有效塔板高度,单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 组分在t0时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：,塔板理论的不足,塔板理论是模拟在一些假设条件下而提出的，假设同实际情况有差距，所以他描述的色谱分配过程的定量关系也有不准确的地方。 对于塔板高度H这个抽象的物理量究竟由哪些参变量决定的？H又将怎样影响色谱峰扩张等一些实质性的较深入的问题，塔板理论却不能回答。 为什么流动相线速度(U)不同，柱效率(n)不同；而有时当U值由很小一下变得很大时，则柱效
32、能（n）指标并未变化许多，但峰宽各异，这些现象塔板理论也无能为力 塔板理论忽略了组分分子在柱中塔板间的纵向扩散作用，特别当传质速率很快时，其纵向扩散作用为主导方面，这一关键问题并未阐述。 塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,速率理论,1956年van Deemter等提出了色谱过程动力学理论速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。 van Deemter方程的数学简化式为,式中u为流动相的线速度；A，B，C为常数，分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数、
33、传质阻力项系数。,A.涡流扩散(Eddy diffusion),A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。对于空心毛细管，不存在涡流扩散。因此A0。,对填充柱有涡流扩散的影响,B. 纵向扩散（longitudinal diffusion）,B = 2rDmr ：弯曲因子，填充柱色谱，r 1。Dm：试样组分分子的扩散系数（cm3s-1）(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;(2) 扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差;(3) 分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩
34、散;,纵向分子扩散展宽度,r为弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况,一般小于1。 Dm为组分在流动相中扩散系数。 Dm 随柱温升高而增加，与柱压成反比;Dm 与流动相的相对分子质量M的关系为DmM-1/2，故在GC中，若用氢气作流动相产生的纵向分子扩散要比用氮气时严重。组分在液体中的扩散系数约为气体中的1/105,所以在液相色谱中,纵向分子扩散一般可忽略。 U为流动相线速度。,如何减小纵向分子扩散?,流动相线速度越高，柱越短，组分在柱内的滞留时间越短，纵向分子扩散程度就越小。 欲使纵向分子扩散减少，应选择球状颗粒和相对分子质量较大的物质作流动相。 柱温低,纵向分子扩散
35、程度就小。,C. 传质阻力,试样组分的分子在两相中进行溶解、扩散、分配时的质量交换过程，称为传质过程；在传质过程中所受到的阻力叫传质阻力。C u =（Cm+C s）u 如何减小流动相传质阻力? 采用细颗粒的固定相 增大组分在流动相中的扩散系数 适当降低流动相线速 选用短柱,速率理论的要点,组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。 速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。 各种因
36、素相互制约，如流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,分离度,分离度是既能反映柱效又能反映选择性的指标，可作为衡量层析柱分离总效能的综合指标，又称总分离效能指标或分辨率。,塔板理论和速率理论都难以描述分离物质的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。分离物质对分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差色谱过程的热力学因素；区域宽度色谱过程的动力学因素。 分离度可判断相邻两组份在层析柱内的分离情况.,R值越大，表明相邻两组分分离越好。 对于两
37、个峰高相同的对称峰，达到基线分离时，Rs=1.5，此时，两组分的分离程度达99.87%。 故常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。 Rs1时，分离程度可达97.72(两个峰高相同)两峰的高度相差10倍，当Rs=1.0时，低含量组分的分离程度只有88%。,如何判断完全分离?,基本色谱分离方程,柱效的影响 柱长Ln，柱长 RS，但分析时间，且峰宽。因此为了增高柱效，用减小塔板高度H的办法比增加柱长要好。 2. 分配比的影响 k , RS, 但k值越大，分析时间越长，峰越展宽。通常k值选在0-10范围内。 改变分配比的方法有：改变柱温或改变流动相性质和组成，或改变固定相。 3. 选择因子 越
38、大，柱选择性越好，对分离越有利。可通过改变固定相的性质和组成或降低柱温等办法，提高。,流速对板高的影响,对应某一流速，液相层析和气相层析都有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效的最高点。对于液相层析来说，为了得到好的柱效，就要控制流速。,分子扩散项和传质阻力与板高的影响,低流速时，分子扩散占主要因素。 高流速时，传质阻力起主要作用。书上图2-11 H=A+B/u+C*u C*u （传质阻力随流速增加而增加，影响显著） A B/u （低流速时，随流速的升高，分子扩散影响下降迅速）,固定相颗粒大小对板高的影响,涡旋扩散 A=2dp，固定相颗粒越小，dp，A，H，柱效n但颗粒小，流速 ，分子扩散B/
39、u就会，就得提高柱压机械强度高，刚性强的填料（HPLC）,凝胶层析,凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等，依据是多孔的载体对不同体积和不同形状分子的排阻能力的不同，从而对混合物进行分离。,排阻层析(Gel Filtration, GF),定义：利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离的方法。 也称凝胶层析或分子筛层析 特点： 20世纪60年代，作为电泳支持介质分离血清中蛋白质；（分子筛作用） 球型微珠，用于液相层析分离介质； 同时，也作为合成带有配基的层析介质应用最广泛的一种载体。 设备简单、操作方便、重复性好、条件温和。,优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，温度范
40、围广，不需要有机溶剂，分离效果好缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变差,凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。,排阻层析分离原理,大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱,排阻层析分离原理,原理：按生物大分子相对分子量大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，保留时间长，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，保留时间最
41、短，出峰最快。 与普通的筛分原理不同：大颗粒不通过，小颗粒通过。,排阻层析介质分离范围,分离范围： 全排阻分子：上限分子，不能起筛分作用的大分子。 部分渗透分子：也称分离分子，是凝胶介质有效分离的分子。 全渗透分子：下限分子，不能起筛分作用的小分子。,有关参数的意义,柱床体积（Vt）：层析介质经溶胀、装柱、沉降、体积稳定后，所占层析柱内的总体积。 外水体积（Vo）：柱床内凝胶颗粒之外、颗粒之间的空隙所占有的水相体积或溶剂体积。 内水体积（Vi）：凝胶吸水溶胀后，存在于凝胶颗粒内所占有的水相体积或溶剂体积。,有关参数的意义,凝胶体积（Vg）：凝胶颗粒自身的体积，柱床体积减去外水体积和内水体积后所
42、占有的体积。 洗脱体积（Ve）：自加样液时开始，到洗脱组分浓度最大时出现的峰为止，所收集的体积。,各参数间的关系,Vt=Vo+Vi+Vg Ve=Vo+KdVi Kd=（Ve-Vo）/ Vi分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流动相间的分配系数Kd，Kd表示某一分子在特定的凝胶柱内的洗脱行为。 与被分离物质相对分子质量大小、凝胶颗粒空隙和网状孔径大小有关。 与层析柱的长短和粗细无关。 可通过实验获得。,Kd的意义,Kd=0 Ve=Vo, 完全不能进入凝胶内部的大分子，洗脱体积等于外水体积。（全排阻分子，无分离意义） Kd=1 Ve=Vo+Vi,完全可以进入凝胶内部的小分子，其洗脱体积就等于
43、外水体积和内水体积之和。（全渗透分子，无分离意义） 01 凝胶具有一定的吸附作用。（ Ve Vo+Vi）,Ve=Vo 该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，因而洗脱速度最快。即该成分的Kd0。 ViVe-Vo 该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部,因而洗脱速度最慢。即该成分的Kd=l。 Kd值介于0-l之间，物质的洗脱速度随其Kd值的 增加而降低一般物质的Kd值是0Kd l。,洗脱行为可以有三种可能的情况:,凝胶层析介质,基本性质 球形颗粒，球内部是多孔网状结构。 需具有化学稳定性 凝胶介质合成后所保留的化学基团必须具有良好的惰性，不与待分离的物质发生化学反应，不影响被分离的物质原有的性
44、质（如生物学活性、构象），在比较苛刻的环境中保持相对的稳定性。 无特异性吸附 凝胶颗粒上不存在或存在极少的离子基团，不与溶液中的离子化合物发生离子交换、吸附或亲和反应，在低离子强度下，洗脱峰不出现脱尾，被分离的物质有较高的回收率。,凝胶层析介质,具有较好的耐受性 对有机溶剂和温度具有较好的耐受性，在高温下不发生熔融，在有机溶剂中不发生收缩变形。 具有较好的刚性好 具有一定的机械强度，在操作压力范围内，柱床体积不发变化，在层析过程中，流速不发生改变。,凝胶层析介质分类,葡聚糖凝胶层析介质： Sephadex 由多聚葡聚糖通过与环氧氯丙烷交联而合成的，具有网状结构的珠状凝胶颗粒。 特性： 交联度与
45、凝胶颗粒网状结构孔径大小有关，交联度越大，网状结构的孔径越小，分离的分子量就越小。 不溶于水和有机溶剂，但具有很强的亲水性（羟基）。 在酸性条件下糖苷键容易被水解，在碱性环境中较稳定。,凝胶层析介质分类,葡聚糖凝胶层析介质 在高盐条件下，体积易收缩，凝胶刚性较差。 在氧化剂的作用下，羟基易于被氧化，增加了带电荷特性，使其非特异性增强。 对温度具有较好的耐受性。（溶胀 1100C、干胶 1200C） SephadexG系列产品：G后面的数字越大，交联度越小，凝胶孔径越大，分离相对分子质量范围越大，凝胶溶胀体积大。（P107表2-5）,凝胶层析介质分类,琼脂糖凝胶层析介质： 琼脂糖基本结构由-D-
46、吡喃半乳糖和3，6-脱水-L吡喃半乳糖相结合而成的链状多糖。 特性： 一种大孔径凝胶，具有良好的亲水性（羟基）。 交联度随着琼脂的浓度增加而增大。网状孔径的大小可通过改变凝胶的交联度来控制。,凝胶层析介质分类,琼脂糖凝胶层析介质 琼脂糖分子中不带电荷，非特异性吸附较少，回收率较高。 经过处理的琼脂糖凝胶，可耐受较高的温度，机械强度也较高。 SepharoseB产品：B前面的数字表示琼脂糖的百分浓度，琼脂糖的浓度越高表示交联度越大，凝胶孔径越小，相对分子质量分离范围越小。（P108表2-6） 耐受一定的高温、酸碱度、及变性剂（6M尿素）。,琼脂糖系列,较常用的是Pharmacia和BioRad两
47、家的产品，前者生产的称为Sepharose，后者的产品为BioGel A。BioGel A 系列的产品有不同的颗粒度，有粗、中和细三档，它们的颗粒度分别为l50m300 m，80m150m和40m80m 。,凝胶层析介质分类,聚丙烯酰胺凝胶层析介质：是由丙烯酰胺单体，先制成丙烯基的衍生物，在交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis)作用下聚合而成多孔性聚丙烯酰胺凝胶珠。产物也是固体粉末，用前先溶涨。 特性： 稳定性不如交联的葡聚糖凝胶。 在酸性条件下酰胺键容易被水解生成羧酸，有离子交换作用，使介质的非特异性吸附增加，应避免酸性较强的缓冲液。 具有良好的大孔性和机械强度。 Bio-GelP产品：P后
48、面的数字越大，表示交联度越小，凝胶孔径越大，相对分子质量分离范围越大，凝胶的溶胀体积越大。（P109表2-7）,凝胶层析介质分类,琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶层析介质：由琼脂糖-聚丙烯酰胺按不同比例制成的混合型凝胶。 聚丙烯酰胺为骨架（刚性好），在其中填充琼脂糖凝胶 刚性好，孔径大。 理化特性介于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶之间。 技术特性见P110表2-8,多孔硅胶,优点：物理化学稳定性高，耐热耐压，使用寿命长 缺点： 柱效较低 、表面具有离子性，对蛋白质有吸附性、不能在强碱性环境中使用,刚性亲水性填料，具有一定直径的多孔网状结构的球状颗粒,凝胶的规格与用途,可根据其用途及纯化规模选用不同的规格。
49、在同一交联度、同一性能的凝胶介质有不同的规格 粒度：粗、中粗、中细、细、超细等。 不同规格的凝胶及用途P111表2-9,凝胶性能的比较,不同种类凝胶，合成介质的原料不同，其分辨率不同。 P111图2-30 同一种类凝胶,型号不同时,分辨率不同。 P111图2-31,基本操作,凝胶的选择 凝胶柱的制备 上样 洗脱 凝胶柱的重复使用与保存,GF分离条件的选择,层析介质的选择 层析介质型号：根据相对分子量分离的范围进行选择 组分分离： 指分离相对分子质量之间差别很大。根据样品中的大分子和小分子分配系数上的显著差异，将其分开， 可选用Sephadex G-25和G-50 小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。选择交联度较大（孔径小）的凝胶层析介质。 组别分离： 指分离相对分子质量之间相差较小。选用分级范围较窄的凝胶，且中间值 接近于目的蛋白的分子量 根据要分离物质的分子量上限和下限进行选择。,
