qPCR引物设计.ppt

1、qPCR引物设计,Novobio Proprietary & Confidential,应用类型 绝对定量（Absolute Quantification） 相对定量（Relative Quantification） microRNA研究（MicroRNA Research） 基因拷贝数变异（CNV Research） 基因分型/SNP分型（Gene Genotyping）,1. Primer blast 引物设计及特异性检验工具,Novobio Proprietary & Confidential,http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

2、整合了Primer3软件，再加上Blast进行引物特异性的验证,Primer blast,Novobio Proprietary & Confidential,输入基因号或FASTA序列,定义引物的范围 （举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范围，则可填入 Forward 1 to 1000, Reverse 1050 to 3000,若有已知引物，可填入，以测试特异性,针对sybr qPCR：产物大小填100 to 200（最大不超过300）,可用默认值（最佳Tm为60度，波动范围57 to 63度，两条引物Tm差值小于3度）,Primer blast,Novobio Prop

3、rietary & Confidential,引物是否需跨不同Exon 选择1 - 无所谓 选择2 - 必须跨不同Exon 选择3 - 可以不跨Exon,勾选时表示两条引物之间必须包括一个以上的Intron（当以基因组DNA为模板时）,基因组DNA干扰的判别,Novobio Proprietary & Confidential,No gDNA detected in the RT control (flat green/red line),Detection of contaminating gDNA in the RT control (dark blue line),no gDNA rem

4、oval,防止基因组DNA污染的两种引物设计方法,Novobio Proprietary & Confidential,Primer blast,Novobio Proprietary & Confidential,勾选时表示要检测引物的特异性,填入要比较的物种（可输入通用名，如human/mouse/rat/rabbit 当需要同时比较多物种时，点击”Add more organisms”,勾选”show results in a new window”-点击”Get Primers”,Primer blast 结果,Novobio Proprietary & Confidential,基因

5、的Exon位置,引物的位置,Primer blast 结果,Novobio Proprietary & Confidential,引物的基本情况,引物和非相关产物的配对情况,2. qPCR引物的网络数据库,Novobio Proprietary & Confidential,PrimerBank is a public resource for PCR primers. These primers are designed for gene expression detection or quantification (real-time PCR). PrimerBank contains o

6、ver 306,800 primers covering most known human and mouse genes. http:/pga.mgh.harvard.edu/primerbank/,PrimerBank 结果,Novobio Proprietary & Confidential,有些引物是附带了验证结果的,Novobio Proprietary & Confidential,Step 1: Stem-loop RT,Step 2: Real-time PCR,成分： 茎环RT引物 正向引物 反向引物（通用） TaqMan探针（可选）,3. miRNA qPCR的引物设计（茎

7、环引物法）,Novobio Proprietary & Confidential,miRNA qPCR引物数据库,数据库来源：MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells，http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1351374/,Novobio Proprietary & Confidential,以has-miR-16为例： 成熟miRNA序列（末端8个碱基用下划线标注） has-miR-16：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG1）RT引物（注：5端

8、为通用的Stem和 Loop序列，末位8个碱基和miRNA末端序列互补） CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA2）Forward primer（注：下划线标记的部分和免去末端6个碱基的靶miRNA序列同源） ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA3）Reverse primer（注：序列固定） TGGTGTCGTGGAGTCG4）Taqman MGB探针（下划线标记部分与miRNA末端序列互补） (6-FAM) TTC AGT TGAG CGCC AATA(MGB),miRNA qPCR的引物设计,Novobio Pro

9、prietary & Confidential,内参U6（Human/Mouse/Rat）的引物 CTCGCTTCGGCAGCACA AACGCTTCACGAATTTGCGT注：U6不属于miRNA,miRNA qPCR的内参引物,附录1 - 染料法引物的设计原则,Novobio Proprietary & Confidential,（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异； （2）、避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构； （3）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子； （4）、引物之间的TM相差避免超过2； （5

10、）、典型的引物18到24个核苷长； （6）、目的基因和内参基因所扩增的PCR产物长度尽量一致，不大于300bp，这样有利于使两种基因PCR效率相同 （7）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其特异性,附录2 - Taqman探针及引物的设计原则,Novobio Proprietary & Confidential,（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异； （2）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子； （3）、引物TM值为60左右，探针的TM值为70左右（确保探针先于引物与模板结合，这就要求探针的TM值高于引物10左右）； （4）

11、、探针的5端应避免使用鸟嘌呤G，因为5G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用； （5）、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量 G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针； （6）、引物之间的TM相差避免超过2； （7）、典型的引物长度为18-24bp，探针长度为15-45bp； （8）、PCR产物长度在50-150bp之间，这样有利于使PCR效率相同； （9）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其特异性,附录3 - Taqman探针合成时注意事项,Novobio Proprietary & Confidential,（1）引物及探针

12、设计好之后，委托一家放心的合成公司合成； （2）先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通PCR，电泳检测PCR产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异性扩增情况，必要时进行PCR产物的测序验证； （3）确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多以外的损失； （4）探针合成好后，先检测一下探针的质量，250nm的探针终浓度，25ul水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量PCR仪上检测，95，2min; 95，20s，60，20s，40个cycles；看荧光本底和荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着PCR反应，荧光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明

13、探针合成质量较差，建议重新合成。,附录4 - 逆转录方法的选择,Novobio Proprietary & Confidential,逆转录方式 1-step (one tube) RT-PCR（病毒检测） cDNA合成与PCR同管进行 快速、更少污染 对于稍微有些降解的RNA检测灵敏度更高 2-step RT-PCR（基因水平变化） 一次cDNA可用于多次PCR,附录5 - RT引物的选用,GSP：常用于一步法RTPCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在扩增低丰度的转录本时是最好的。 Oligo dT引物:真核生物的mRNA适用，建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；不适用于降解的RN

14、A 随机引物：适合各种RNA的RT，可用于mRNA片段的逆转录。,2-step Real-time RT-PCR的逆转录引物选择,Novobio Proprietary & Confidential,Amplicon 3-end: 6 kb,(A)n,使用Oligo-dT作为引物：扩增离3端远近不同的片段，离3越远扩增越差 必须使用Oligo-dT+(N)9,附录6 qPCR引物的验证结果示意,Novobio Proprietary & Confidential,2% Agarose Gel Image(Right: DNA ladder of 100bp, 200bp, 400bp, 800bp, 2000bp),Experimental validation data amplification plots, dissociation curves 2% agarose gel analysis sequencing and BLAST data （可选） 标准曲线-扩增效率（可选）,