1、医学生物学研究技术与实验实验报告实验名称：细胞总蛋白的制备, SDS-PAGE，Western Blot一、实验目的1. 掌握 SDS 直接裂解细胞法提取蛋白质2. 掌握 Lowry 法测定蛋白质浓度的原理3. 掌握 SDS-PAGE 分离蛋白质的原理和技术4. 掌握半干转移的操作和 Western Blot 的原理和技术二、实验原理1. 蛋白质提取常见裂解方法极其原理。蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁
2、破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。膜蛋白的抽提比较复杂。膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及 PH 的缓冲液，其中要好友 EDTA，将其抽出。固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏水性尾部结合。在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。较为理想的增溶剂是去垢剂。目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。纯化后的膜蛋白，可通过透析法去
3、除去垢剂，进行膜蛋白重组。抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水解酶活力，以减少细胞的自溶过程。主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100 或者 NP-40 等非离子去污剂 （比较温柔） ，4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈） ， 5 上样缓冲液（含 SDS）细胞 沸水浴 5 min，6 匀浆器。2. Lowry 法测定蛋白质浓度1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物；2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色
4、，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测 A750 吸光度，做标准曲线3. SDS-PAGE 分离蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与 SDS 结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。4. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE
5、)是在不加入 SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下， 对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加 SDS 的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。5. 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理不连
6、续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH 值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。（1）浓缩效应 样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的 Cl有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=60) 泳动速度最慢，被称为慢离子。由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高
7、电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。 （2）电荷效应 当各种离子进入 pH89 的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和 pH 的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。 （3）分子筛效应 由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通 过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不
8、同而被分离。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。图 1 电泳操作示意图表 1 凝胶浓度与蛋白质分离范围的相关联系。6. 转膜( 半干转移 )法蛋白质带负电，电场中会向正极移动，而 PVDF 膜在凝胶和正极之间，将蛋白质拦截在膜上，PVDF 膜可以牢固吸附蛋白质，使蛋白质保留在膜上。将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间： |纸|胶|膜|纸|，如图 2 所示。图 2 转膜(半干转移) 法示意图三、实验步骤1. 制胶:玻璃板上做好标记（加样孔位置和分离胶位置）配制分离胶溶液，一旦加入TE
9、MEM 就立即灌胶，上加水饱和正丁醇，待凝弃去正丁醇，蒸馏水冲洗，滤纸吸干多余水分配制浓缩胶溶液并灌胶，插梳子，待凝取下制胶器，插入电泳槽中，上槽加电泳缓冲液，没过小玻璃板，下槽加一半量的电泳缓冲液（TGS） ，拔梳子2. 细胞总蛋白的制备： 收集 1 管细胞，3000rpm 离心 5 分钟弃上清，沉淀以 10mLPBS 垂悬洗涤，同上离心，再次以 1mLPBS 垂悬沉淀并移入 1.5mL 离心管，再次离心，弃上清加入 5 倍体积的 4%SDS 溶液垂悬，用枪吹打搅匀，沸水浴中加热 5 分钟以黄色枪头反复吹打搅匀数十次，以使溶液不再粘稠，10000rpm 离心 10min准备 2 个 EP 管
10、，分别取上清液 15L，加入 5L 4上样缓冲液，混匀后沸水加热 3 分钟，冷却到室温，混匀并短暂离心即可用于上样。3. 转膜： 准备好 2.5 7cm 大小的厚滤纸 2 张和膜 1 张，其中膜先用甲醇处理 23 分钟，再浸泡于转移缓冲液中取下胶，滴加转移缓冲液以起到固定作用，切取相应大小的胶，浸泡于转移缓冲液中平衡 15min转膜条件：200mA，1h；稳流： 0.8mA/cm2 膜面积。4. 封闭保存： 转移结束，取下胶和膜，胶置于染液中染色；膜做好标记，封闭液中保存于 4冰箱。5. 考马斯亮蓝染液检查条带情况： 凝胶放入考马斯亮蓝染液中，加盖，在摇床上染色 2 小时以上弃染液（可回收重复
11、用） ，换脱色液慢摇，脱色液变成蓝色的时候更换新的脱色液。直到凝胶背景无色，蛋白质条带呈清楚的蓝色为止。6. 抗原抗体反应以及膜的反应性检测： 4 封闭过夜，取出预温至室温将兔抗人 c-Myc 单抗 2.0ml（用封闭液 1:1000稀释）加入塑料袋，放入 PVDF 膜，赶走气泡，用封口机封口，室温平缓摇动 1.5 小时PBST 洗膜三次，每次 10min将 AKP 标记的羊抗兔 IgG 抗体 2ml （用封闭液以1:2000 稀释）加入塑料袋，放入 PVDF 膜，赶走气泡，用封口机封口，室温平缓摇动1 小时PBST 洗膜三次，每次 10min将 PVDF 膜放入检测缓冲液中平衡 5 分钟将2
12、 ml 的检测缓冲液加入新塑料袋中，加入 40 微升 NBT/BCIP 浓贮备液，混匀将 2 ml的检测缓冲液加入新塑料袋中，加入 40 微升 NBT/BCIP 浓贮备液，混匀弃去显色液，水冲洗。四、实验结果图 3A：电泳结果检查图 3B：转膜后转膜情况及抗体标记后检测1. 电泳结果和转膜结果检查：经 SDS-PAGE 分离得到的蛋白质，经不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳后，取下凝胶，其中一半胶经切割，使用考马斯亮蓝染液在培养皿染色，另一半经过半干转移后的胶经过考马斯亮蓝染液染色后的结果在图 3 显示。其中可以看到：经过考马斯亮蓝染色的胶（图 3Aa）的左边形成蛋白梯度，右边为 marker 经过染色
13、形成的条带。经过转膜后的凝胶经过考马斯亮蓝染色后，如图 3Ab 所示，大部分蛋白和 marker 都被转到膜上，只剩下一些大分子蛋白残留。2. 转膜后转膜情况及抗体标记后检测：转膜后，PVDF 膜后经一抗、二抗结合后过夜，显色，经过约 20min，显色情况如图3B 所示。可见 PVDF 经显色后背景呈淡红色，右条带为 Markers，左条带未有显示。五、实验注意事项1. 蛋白质样品制备过程中需要注意：（1）制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。（2）样品处理中使蛋白质充分变性，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共 价键二硫键。 A Ba b（3）样品建议分装冻存，避免反
14、复冻融。2. SDS-PAGE 电泳过程中需要注意：（1）加入试剂后摇匀，防止部分胶块聚合不均匀，摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多氧气。（2）温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀。（3）加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以减少蛋白质带的拖尾现象。（4）为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。 （5）低电压短时间的预电泳（恒压 10-20V，20-30min） ，清除凝胶内的杂质。3. 转膜过程中需要注意：（1）滤纸、胶、膜之间不能有气泡。（2）滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序。胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下 。（4）PVDF 膜需要 100%甲醇预处理，后续操作中膜
15、必须保持湿润。4. 影响抗原抗体反应的因素：（1）电解质：电解质可促进抗原抗体复合物的形成，因此常选用各种缓冲液做为抗体的稀释液。（2）酸碱度：抗原抗体反应需要适宜的 pH 值环境，一般为 pH6.08.0。（3）温度：温度升高可使反应加速，但温度高于 56时，可导致抗原抗体的解离，甚至变性。六、实验讨论此次讨论重点为：本次试验结果无条带原因：转膜后，经过一抗二抗标记和染色，理论上 55-80kDa 之间应当显示 c-Myc 的蛋白条带（图 4） 。图 4：理论上应该出现的转膜后条带需要考虑的原因有以下几个方面：（1）蛋白样品制备（2）检查胶：考马斯亮蓝染胶（3）检查膜：丽春红 S 染色（4）
16、抗体滴度太低（ 5）显色过程中有问题（6）试剂放置太久或存放条件不正确。从直接考马斯亮染色的未经转膜的胶上可以看出，我们是分离出蛋白质的，和邵红霞老师所做实验相对比，本组条带颜色较浅，在蛋白质提取方面可能出现了问题，使得提取的蛋白量减少，浓度下降。从另一块未经转膜的胶上可知，本组提取的蛋白是存在的，即便是量比较少，也应该在延长时间等调整下，出现微弱条带，但是经过时间的延长，还是没有出现条带；经了解，本实验室其它实验组也无人做出条带，故分析此结果也有可能为抗体原因。从抗体角度分析，有以下几个原因导致抗体使用受限，效价降低：（1）抗体试剂存放较久或者经过反复冻融，是的抗体产生降解。（2）抗体不纯或者低度太低。因为此次加入抗体之前未经条件的摸索，在抗体浓度的使用上没有经验，所以可能导致加入抗体过多或者过少。因为邵红霞老师在孵抗体的时候，蛋白质较多，本组蛋白质较少，使得抗体相对较多，阻碍抗原抗体反应。（3）一抗和二抗之间的相关因素有：一抗和二抗不匹配；一抗和二抗至少有一个浓度较低。如果从蛋白角度分析，则可能为样本中靶蛋白含量过低导致抗原失效。转膜不充分或者洗膜过度也可能为没有出现条带的原因。此外，过度的封闭也会导致此现象。按道理来讲，使用含 0.5%的脱脂奶或者无脱脂奶的抗体稀释液封闭过夜即可，但此次封闭了一周，有可能导致过度封闭。
