1、 胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 1 第一部分 项目运行意义概述胸苷激酶 1 简称 TK1，是一种国际公认的细胞增殖特异性标志物；它参与 DNA 补救合成途径,是 DNA 合成的特殊标志酶。临床上,可用于监测和评估体内细胞的异常增殖速度。 健康人细胞多处于静止状态（非增殖细胞） ，血清中的 TK1 酶含量极微，而随着增殖类疾病的发生，尤其是肿瘤、组织异常增生类疾病，细胞发生过度增殖，血清中 TK1 酶的含量出现显著升高，超过健康人平均水平 2 倍甚至 100 倍以上。所以，通过检测血清中 TK1 浓度水平的变化，能够敏感地发现细胞增殖异常，动态评估细胞增殖发展趋势，为提前干预治疗高风险癌
2、前病变，遏制肿瘤进程提供重要信息。 在瑞典卡罗琳斯卡大学(诺贝尔医学和生理学奖评审机构)二十多年的研发基础上,华瑞同康生物技术（深圳）有限公司与瑞典 Karolinska大学 TK1 研究团队共同研制出高灵敏度的胸苷激酶 1（TK1）细胞周期分析试剂盒及 CIS 系列化学发光数字成像仪，该系统是世界上唯一用于临床检验血清中 TK1 浓度的产品，其特异性高于 95%,对各类增殖性疾病的综合检测灵敏度高于 70%。该系统已在多临床领域得到较为广泛地应用：1、独立的肿瘤预后因子：多国家，多机构的研究表明，TK1 是优选的预后评估指标，可作为独立的肿瘤预后因子；2、动态评估手术、放化疗效果：能够对各种
3、实体肿瘤（例如：肺癌，胃癌，结肠癌，直肠癌，食道癌，乳腺癌，宫颈癌，前列腺癌等）以及白血病和淋巴癌患者的治疗效果进行评估，为治疗方案的改善提供参考；3、更早评估肿瘤复发风险：对肿瘤康复期患者进行动态跟踪，较影像学更早提示肿瘤复发或转移风险信号；4、评估各类增殖类疾病恶变风险：处于过度增殖的增殖类疾病是肿瘤形成的第一步。基于 TK1 与细胞增殖的密切关系，能够灵敏地通过 TK1的浓度变化，发现恶性增殖风险，为肿瘤的癌前干预提供了更有效率，更有价值的信息，适用于无疾病人群的恶性增殖风险筛查。胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 2 第二部分 项目运行准备一.项目环境1、 环境参数温度： 24-25
4、；湿度：小于 65%；实验用水：（1） 双蒸水；（2） 去离子水；2、 实验室设置要求：（1 ） 项目最小占地约 8-9 平方米；（2 ） 工作区域可放置两张 1.5m0.8m 或一张 3m1m 工作台；（3 ） 控温设备：30 立方米左右的独立空间，可选用 2 匹的挂式空调进行控温,或选用恒温摇床，如下图：胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 3 二、项目所需设备1、实验用设备编号 设备名称 规格要求 数量 用途1 化学发光数字成 像分析仪 CIS 系列 1 采集发光信号和 分析数据2 脱色/恒温摇床 （平摇） 20-100r/min 可调 1 免疫孵育3 台式离心机 0-4000r/min
5、 1 分离血清4 冰箱 冷藏 2-8冷冻-20 1 保存试剂保存样本5 打印机 USB 数据接口 1 输出检测结果6 恒温水浴锅 单孔或双孔 1 控制反应液温度2、实验工具及耗材（1）实验用工具：编号 工具名称 规格要求 数量 用途1 移液器 0-10l 或 1 血清点样2 移液器 20-100l 1 配制反应液3 移液器 100-1000l 1 分装和检测样本4 试剂瓶 500ml 2 配制工作液6 烧杯 100ml 2 配制工作液7 电子计时器 无 1 实验提醒8 探头温度计 -50-50 1 控制实验温度9 塑料镊子 平头 1 实验需要10 反应盒 24T、48T、96T 各 1 适用于
6、对应规格 的产品使用11 量筒 25ml 1 配制工作液12 量筒 250ml 1 配制工作液（3） 实验耗材胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 4 编号 耗材名称 规格要求 用量 用途1 移液器枪头 20l 1 个/样本 配套 0-10l 移液器使用2 移液器枪头 200l 2 个/次 配套 20-100l 移液器使用3 移液器枪头 1ml 1 个/次 配套 100-1000l 移液器使用4 分装管 500l或 1ml 1 个/样本 血清分装时使用5 吸水纸 无 - 保持环境清洁，防止膜 污染6 精密 PH 试纸 5.5-9.0 - 测定缓冲液 PH 值三、实验样本处理要求及保存样本种类：
7、血清采集要求：1、 必须使用无任何添加剂的真空采血管；2、 取静脉血 2ml（室温） ；3、 建议空腹采血；4、 脂血、溶血样本可能造成实验结果的偏差，不建议使用；样本处理： 1、 采血完成后，室温下静置或 37水浴至凝固后离心使用；2、 离心转速：4000r/min，离心时间：5min；注：室温放置时间不宜超过 3h；样本保存：1、 离心后的血清如非即时使用，应立即分装，推荐血清分装量100-200l/管，放置于-20保存；2、 -20保存时间以不超过 7 天为佳；3、 如需长时间保存，建议提高分装量（1.5ml） ，并放置于-80（可保存 3 年左右） ；样本运输：胸苷激酶 1（TK1 ）
8、项目指导手册 5 1、 样本如需外送检验（本市范围内或行程小于 3 小时） ，建议采血后先放置于 2-8静置，到检验点后取出离心，处理要求同上；2、 样本如需外送检验（外省市） ，建议离心后分装至分装管中，血清分装量 1.5ml/管，运输介质建议使用保温箱+化学冰+干冰，干冰用量 2 公斤/24 小时（根据路程耗费时间增量） ；样本复融：1、 血清使用前需充分振荡混匀；2、 冷冻保存的血清样本，需放置于室温完全解冻后使用；3、 反复冻融的血清样本严禁使用。第三部分 项目核心产品简介一、胸苷激酶 1 细胞周期分析试剂盒注 册 号：粤食药监械（准）字 2014 第 2400369 号规 格：24
9、人份、48 人份、96 人份储存条件：2-8有 效 期：6 个月（具体日期见试剂盒标签）使用要求：开封后一次性使用实验用时：单次实验用时 5-6h（根据样本数量有所差别） ；工作通量：300-400 人份/天胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 6 图 1主要组成成份：试剂盒由校准品、抗 TK1-IgY、生物素化抗 IgY 二抗、SA-HRP、ECL1、ECL2、浓缩稀释液、浓缩洗涤液、封闭剂、硝酸纤维素膜主要成分组成。组分名称、装量详见产品说明书，并以产品说明书为主。二、CIS 系列化学发光数字成像分析仪注 册 号：粤食药监械（准）字 2011 第 2400879 号1、设备性能参数系统偏差
10、：5%成像灰度等级：12bit(2 12)分辨率：1392（H）1040（L）光学镜头：几何形变率小于 1%拍摄范围： 12cm9cm 可调工作环境温度：10-30单次批处理能力：96 人份/次读出噪音：7 e-rms20MHz降噪能力：专业级高效半导体制冷 CCD，集成噪音软处理功能2、主要结构部件CIS-2 化学发光数字成像分析仪、免疫点印迹分析软件、加密狗、胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 7 Lenovo 一体机。图 2第四部分 项目实验操作一、项目原理概述1、TK1 检测：先将含有 TK1 抗原血清吸附在硝酸纤维素膜固相载体上，用抗人TK1-IgY 抗体识别抗原（A） ，生物素化
11、抗 IgY 二抗识别抗原-抗人TK1-IgY 抗体并进行信号放大（B） ，亲和素化辣根过氧化物酶与生物素连接（C） ，在加入发光底物后，亲和素化辣根过氧化物酶催化底物发光，发出的光信号强弱光信号（D） ，必须通过 CCD 的信号采集设备进行采集和分析。 （如图 3）胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 8 图 32、实验结果分析：将反应完毕的样本载体，放入暗室（避免外界光的干扰） ，通过精密的制冷 CCD 长时间曝光将化学发光强弱信号转变为数字信号，保存后得到样本发光图片，通过校准品固定浓度与亮度的关系，绘制标准曲线，进而计算出其他样本 TK1 的浓度。二、实验操作流程1、实验准备部分：1.1
12、 血清准备：请参照实验样本处理要求及保存章节；1.2 试剂工作的最佳温度为 25-26，请使用空调和恒温水浴锅等保证实验工作液温度达到该标准；1.3 实验前需仔细清洗玻璃器皿：洗涤液清洗清水冲洗实验用水润洗1.4 检测实验用设备和工具是否都处于正常工作状态（包括化学发光数字成像分析仪） ，对于发现的异常情况进行及时排除；1.5 按照说明书要求配制实验所需的稀释液和洗涤液，保证配制好胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 9 后的 pH 值在 7.2-7.8 之间；2、实验操作控制1、 点样：取出点样板，为防止污染在点样板下放一张白纸，样本上样量为 3l；a.取样后，枪头贴壁 2-3 次；b.加样
13、枪垂直；c.扶稳加样枪，枪头固定于孔中央；d.保证样本打出后直接被膜吸附；2、 晾干：将膜从点样板中取出，揭掉背面蓝色保护膜，放置于温度 28-30，湿度小于 65%的环境进行晾干，时间为 30min；3、 漂洗：待膜晾干完毕，将膜放入反应盒，倒入双蒸水或去离子水，使膜浸没于水中，以 60-70r/min 的转速洗涤 2 次，每次 1min;4、 封闭：封闭剂使用稀释液配制（3g 封闭剂+50ml 稀释液） ；使用磁力搅拌器混匀 5min（或用手快速搅匀 10-15min） ，至没有封闭剂颗粒和沉淀为止；将晾干后的膜放入反应盒中，倒入封闭剂；以 35-45r/min 的转速摇动，时间为 30m
14、in；5、 抗 TK1-IgY 抗体反应：将封闭液摇匀（盒底无沉淀）后倒出，然后加一抗反应液（一抗稀释浓度见试剂盒内说明书） ，并以 400l 封闭剂/10ml 反应液的比例添加封闭剂；以 35-45r/min；反应 2h；反应液温度控制在25左右；6、 洗涤：倒去一抗反应液，先用洗涤液迅速漂洗两次，再倒入洗涤液以60-70r/min 的转速洗涤 3 次，每次 5min；7、 生物素化抗 IgY 二抗：胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 10 按说明书稀释倍数进行稀释， 35-45r/min 反应 40min；反应液温度控制在 25左右；8、 洗涤 同 69、 SA-HRP：按说明书稀释倍数
15、进行稀释， 35-45r/min 反应 60min；反应液温度控制在 25左右，10、洗涤 同 611、ECL 发光：取出洗涤好的膜，在吸水纸上控干后放在发光盒中，将 ECL1、2 液混合后均匀倒在膜上，计时反应 1min，反应完成后，立即开始倒计时 5min，将膜夹入压膜片中，用滚筒压平，放入化学发光仪中调整位置（十字交叉中心） ，关闭暗箱门，5min 倒计时结束后进行拍摄。三、实验结果分析1、工作前准备：1.1 连接好电源，启动设备（可在拍摄前 5min 启动） ；1.2 运行免疫点印迹分析软件；在登录界面输入用户、密码后，进入软件操作页面（异常情况 1） 。2、实验结果获取流程2.1 预
16、拍 将实验膜片放入化学发光仪中调整位置（十字交叉中心） ，关闭样本台；点击工具栏“系统”选择“读取 CCD”，或者点击快捷按钮 单击“预拍” 。2.2 实验图像的获取：预拍结束后点击“读取图像” ，即开始读取图像，读取完毕后会弹出“实验图片拍摄完毕，请取出模板”的提醒（异常情况 2） ，胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 11 取出膜片后，重新关闭样本台，点击“读取背景图像” ，倒计时结束后点击“应用” ； 2.3 实验图像的处理点击“应用” ，软件即会对图像自动进行背景扣除并自动压缩显示范围，生成结果图像，点击“关闭”关闭 CCD 对话框。2.4 实验图像的保存点击“图像”“另存待分析图像
17、（pwk） ”，或快捷按钮 ，选择保存位置保存待分析图像后关闭图像，所保存的文件后缀名为“pwk” ，保存后关闭分析仪电源。建议：每天的实验结果建议保存在独立的文件夹，文件夹命名规则：实验时间+试剂批号，例如：20131212-NT1131101A图 43、图像分析操作方法3.1 新建实验和工作图像的获取点击“实验”“新建实验” ，或快捷按钮 ，打开新建实验对话框，填写实验名称、报告人、审核人等，点击“确定” ；点击“实验”“导入数据”“打开待分析图像” ，或直接点击快捷按钮 ，在弹出的对话框中找到 2.4 中保存的 pwk 文件，点击打开即可进入分析。3.2 工作图像的分析“图像”“反视”
18、，或直接点击快捷按钮 根据斑点数的多少，点击 上下箭头选取合适的模板如 46，再点击右侧的“显示模板”按钮 ，如需不同尺寸的模板框可胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 12 选择“其它”,在弹出的“自定义模板尺寸”对话框中选择合适的“行数” “列数” ，然后点击“保存，打开模板后利用上下左右箭头移动(快速移动同时按下“ctrl+方向键”) 使得所有斑点刚好都在选框内，框好点击快捷按钮“计算” ,在弹出对话框中选“yes” ，软件将自动进行计算，计算结束按下图样式将原始图像、工作图像、线性图和数据四个图表显示。图 5四、实验结果评价1、实验亮度标准1.1 实验亮度查看方法：在完成 3.1 实验
19、图像处理后，点击工具栏“实验”“重置 raw 原始文件”出现“编辑原始 Raw 图像”对话框，单击“范围压缩”在最小值为“0”的情况下，最大值则代表实验亮度水平（异常情况 3、4） 。胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 13 1.2 实验亮度水平判断标准由于 CCD 有本底的电子噪音，当实验结果的亮度水平低于50 时，会使样本的计算结果产生比较大的偏差。2、校准品线性标准2.1 校准品线性的查看方法：在工作图像分析完成后， “线性”窗口上方会显示：R=X.X（如图 5） ，R 即代表校准品线性；2.2 校准品线性的评价标准线性的好坏反应了校准品亮度与浓度的对应关系，R 值越接近于 1，对应关
20、系越好，在实验控制时，要求 R0.99。 （异常情况 5） 。五、实验操作常见问题异常情况 1：提示无法检测到加密狗处理建议：重新安装加密狗驱动。点击图标 文件进行加密狗安装，出现如下图 6所示时，需选择驱动类型：胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 14 图 6一体机有 USB 口，使用 USB 加密狗，选择 USB 狗驱动,再点击安装。异常情况 2：CCD 读取图像时超时，且不出现拍摄结束提示情况分析：内存使用率高，造成读取 CCD 图像时出现的假死现象处理建议：请勿重新启动或强行关机，多耐心等候 12 分钟，内存读取正常后，会弹出提醒框，可进行后续操作异常情况 3：背景消除后，仍未看到明
21、显的样本点情况分析：1、设备长时间未使用，造成本底电荷较多未能够清除；建议：（1）每次拍摄前，进行“预拍摄” ，可达到去除过多本底电荷的效果；（2）按照查看实验亮度的方法，调出“范围压缩”对话框，降低最大值数值，直至能够清晰看到样本点，重新保存图片进行分析。胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 15 2、在上述两种方法调整仍未见样本时，可能出现了实验操作错误（抗体添加顺序错误或漏加抗体、拍摄时未取出膜片等）造成的无发光结果，请回想实验过程，并计划实验重做。异常情况 4：实验亮度偏低实验图像处理后，亮度水平达不到标准（图 7）：图 7：左：亮度 22（亮度异常）右：亮度 98（亮度正常）1、可能
22、原因及解决方法：A配置好的反应液温度低于 25；建议：当冬季或测量反应溶液低于要求时，尽量使用水浴锅为反应溶液保温；B、由于晾干温度或湿度问题造成的晾干不充分；建议：晾干温度保证在 28-30，湿度不超过 65%，如果温度难以保证，可适当延长晾干时间，以膜完全干透为准；C、移液器或枪头问题造成抗体配置比例偏差大；建议：1、移液器定期校准；2、使用进口枪头；D反应器皿或其它污染造成抗体效价降低：建议：1、实验前仔细清洗反应器皿；2、实验工作液当天配置当天使用；3、检查排除实验室是否存在其它有机气体污染；E实验用水不合格，存在污染：建议：定期对净水器进行检查，清洗、消毒储水桶，使用合格用水。胸苷激
23、酶 1（TK1 ）项目指导手册 16 异常情况 5：校准品点样顺序错误当实验人员由于点样不慎，造成如下图的结果时：图 8（左）：校准品 2、3 顺序错误 图 9：（下）修改前， （左下）修改后先按照正常流程计算结果，分析结束后再进行调整。操作步骤：点击“工作图像”的标题栏处激活相关菜单功能，点击菜单栏“斑点”“区域”“椭圆” ，在工作图像上圈定A2，再点击“斑点”“编辑斑点” ，在弹出的新斑点中填入A3、1 行、3 列。填写完毕后点击“确定” ，弹出询问框选择“yes” ，操作成功会弹出“操作成功”按“OK”确认,同样的方法将 A3 修改为 A2。再点击“实验”“显示实验结果” ，软件将重新进
24、行计算并将结果重新显示，得到如图 9 结果。胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 17 第五部分 项目应用介绍一、临床应用1、临床应用价值（1）基于不同类型肿瘤和个体细胞异常增殖度的差异，血清 TK1 浓度测验真实评估细胞异常增殖病变的进展；（2）通过对肿瘤细胞增殖度水平检测，进行肿瘤患者预后评估；（3）提示康复期患者癌细胞增殖异常变化，预测复发风险。（4）动态监测手术及放化疗期间肿瘤细胞增殖速度状态的变化，为个体化治疗方案制定提供重要信息；2、临床跟踪方法及评估标准（1）手术+化疗监控方案治疗方案 样本采集时间选择1 新辅助化疗化疗前 1 天；化疗开始后（2-3）天；化疗结束后，手术前 1
25、天；手术后 1 个月；手术后 3 个月；手术后 6 个月；2术后（放疗后）化疗术前 1 天；化疗前 1 天；化疗开始后（2-3）天；第 2 疗程开始前 1 天；第3 疗程开始前 1 天；第 4-6 疗程开始前一天；3 姑息性化疗化疗前 1 天；化疗开始后（2-3）天；化疗间歇期，下个疗程开始前 1 天；治疗结束后 1 个月；治疗结束后 3 个月；治疗结束后 6 个月；胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 18 （2）手术+放疗+化疗监控方案治疗方案 样本采集时间选择1 手术前放疗（或放化疗联合）放疗前 1 天；放疗开始后（2-3）天；放疗结束后，手术前 1 天；手术后 1 个月；手术后 3 个
26、月；手术后 6 个月；2 手术后放疗（或放化疗联合）手术前 1 天；放疗开始后（2-3）天；第 2 疗程开始前 1 天；第 3 疗程开始前 1 天；第 4 疗程开始前一天；3 只进行放疗（或放化疗联合）放疗前 1 天；放疗开始后（2-3）天；放疗间歇期，下个疗程开始前 1 天；治疗结束后 1 个月；治疗结束后 3 个月；治疗结束后 6个月；手术治疗评估标准A、 术后 1 个月血清 TK1 水平明显下降，为术前水平的 50%左右；B、术后 3-6 个月，血清 TK1 水平接近健康人平均水平 （0.5pM/L） ；C、长期（术前及术后 3-6 个月）维持在低水平（0.5pM/L） 。化疗效果评估标
27、准A、各疗程之间，血清 TK1 水平下降明显（一般 50%左右，视不同肿瘤血清 TK1 半衰期差别有变化） ；B、治疗后三个月，血清 TK1 水平接近并稳定在健康人平均水平（0.5pM/L） ；胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 19 C、在持续治疗过程中，未观察到血清 TK1 诱发高峰。二、体检应用1、体检应用价值（1）早期发现存在身体内部的细胞异常增殖状况（2）在影像不可检测前风险筛查，癌前疾病进展的预防肿瘤早期的发生 建立能有效预测癌症发生的风险模型 分析罹患肿瘤因素，早期建立追踪随访档案 健康教育和不良生活方式干预 基础：获得组织及血液标本中能预测癌症发生风险的分子标志物2、体检结解读表胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 20 TK12.0PM/L检测值说明 体内细胞增殖度正常 体内存在细胞异常增殖跟踪建议对自身健康仍需关注，建议每半年至一年进行一次 TK1 检测炎症，病毒或细菌感染可致 TK1 临时性升高，1 个月症状消失后复检，TK1 应下降至正常水平。身体患有如脂肪肝，胆结石，乙肝，乳腺增生，前列腺增生，胃，十二指肠溃疡，囊肿/息肉等可致 TK1升高，应结合临床症状，并建议每三至六个月复检 TK1进行跟踪。其他检测方法提示疑似肿瘤，同时复检 TK1 仍然升高，建议去医院临床科室进一步诊疗。胸苷激酶 1（TK1 ）项目指导手册 21
