1、第九章 分子杂交技术 Hybridization technique,概念： 在DNA与DNA，DNA与RNA之间，存在 着碱基互补的关系，在加热或加入变性剂等条件下，DNA双链之间的氢键被破坏，双链解开成为单链，此时加入有互补序列的DNA或RNA，在一定离子强度和温度下保温，则加入的DNA或RNA可与模板链形成稳定的DNA-DNA或DNA-RNA异源双链，此过程称为杂交。,主 要 内 容,核酸杂交的基本理论核酸探针核酸分子杂交方法蛋白质分子杂交,第一节 核酸杂交的基本理论 DNA的变性与复性,DNA变性 方法 热变性：90100 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 特
2、点：粘度增加、密度增加、增色效应、熔解温度(melting temperature,Tm) DNA复性或杂交(hybridization) DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等,核酸分子杂交的原理,第二节 核酸探针,探针指的是能与特定的靶分子（DNA或RNA）发生特异性结合的核酸分子,DNA/RNA探针,主要内容,探针的分类,探针的标记,标记物,一、探针的分类,DNA探针 cDNA探针RNA探针 寡核苷酸探针,根据核酸探针的来源及性质可分为：,这类探针多克隆在质粒载体中，无限繁殖，制备方法简便。DNA探针不易降解（相对RNA而言）DNA探针的标记方法较成熟cDNA探针用这种技术获得
3、的DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。,DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点有下面三点：,RNA探针的主要优点有,RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳定性高，因而杂交的特异性更高。单链RNA分子由于不存在互补双链的竞争性结合，其与待测核酸顺序杂交的效率较高。RNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少。杂交后可用Rnase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。,由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的
4、Tm值。一次可大量合成寡核苷酸探针（110mg），使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。,寡核苷酸探针,切口平移法(nick translation) 随机引物法 聚合酶链式反应法T4多核苷酸激酶标记DNA5末端 DNA快速末端标记 化学标记技术:直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上,二、探针的标记,切口平移法该技术由Kelly等于1970年创立。 其原理是首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制造一些切口（nick ）,切口处会形成3羟基末端，这时再在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3羟基上，同时，根据大肠杆
5、菌酶DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性，此酶将缺口5侧核苷酸依次切除。 其结果是在切口平移。 用切口平移法标记的DNA探针能满足大多数杂交要求。,随机引物延伸（random primer)这是以单链DNA或RNA模板合成高比活性32P标记探针所选用的方法。 原理是使长68nt的寡核苷酸片段与变性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I或反转录酶的作用下，以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNA链的合成，在反应时将-32PdNTP掺入合成链，即得到标记。变性处理后，新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小的探针DNA。因为所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可与模板DNA随机
6、发生退火反应，因此被称为随机引物（random primer）。 这种随机引物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备。,聚合酶链反应 PCR技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标记高比活性DNA探针。 PCR技术具有很高的特异性，可在12h之内大量合成探针DNA片段，如果在底物中加入-32PdNTP或其它标记的dNTP，则探针DNA合成过程中可得到很好的标记，标记物的掺入率可高达70%80%。 因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记。 该法的缺点是要合成一对特异性PCR引物。 使用从探针DNA上制备的小片段作引物也能取得较好的标记效果。,T4多核苷酸激酶标记DNA5末端寡核苷酸探
7、针或短的RNA和DNA探针可选用此法标记，寡核苷酸探针一般多用这种方法标记。在大肠杆菌T4噬菌体多聚核苷酸激酶（T4PNK）的催化下，将-32P-ATP上的磷酸连接到寡核苷酸的5末端上。要求标记的寡核苷酸5端必须带羟基。反应式为：,三、标记物,放射性同位素 1）灵敏度极高，可以检测10-1410-18 g 的物质。最适条件下，可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。 2） 放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，对酶促反应无任何影响，不会影响碱基配对的特异性、稳定性和杂交性质。 3）特异性高，假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。 其缺点是： 1）放射性污染。 2）过强的放射线可以造
8、成核酸分子结构的破坏。 3）半衰期短，标记后立即使用（32P/14.3d 35S/87.1d 3H/12.1y ）。,常用的放射性同位素有：1）32P放射性强，穿透性较强，因此自显影所需时间短，灵敏度高。广泛应用于各种滤膜杂交和液相杂交。射线散射严重，分辨率不高 2）35S 可以取代磷酸分子上的一个氧原子，但分辨率高（可用于核酸序列测定及细胞原位杂交）。半衰期较长。灵敏度较P低 3）3H 散射极少，半衰期长自显影时间较长 4）125I 、131I 散射小，分辨率高，显影时间比H短很多。具有挥发性，吸入后蓄积,非放射性标记物有下述几类：金属如Hg，荧光物质如FITC；半抗原如地高辛；生物素；酶类
9、如辣根过氧化物酶（HRP）； 半乳糖苷酶或碱性磷酸酶（AP）等。,非放射性同位素,无放射性、稳定性好灵敏度及特异性不高,图20-4 生物素标记核酸探针荧光免疫反应图解,图 生物素标记核酸探针荧光免疫反应图解,非放射性探针标记的显色体系,AP显色体系： AP BCIP BCI-OH + NBT紫色 BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸，NBT：四氮唑蓝 HRP显色体系：HRPH2O2 DAB2NH2 棕色+ 2H+ +H2O ABC显色体系： DNA B + SA APDNA B SA-AP或DNA B +SA - BAPDNA B SA BAP经上述两反应，把AP连接在DNA上以后，再进行AP酶显
10、色。SA为Streptavidin（链霉亲合素），BAP为生物素化的磷酸酶，B为生物素（ biotin），ABC为Avidin Biotin - Enzyme complex, 即亲合素- 生物素-酶复合物。B和SA还可以换成DIG和ANTIDIG,在选择标记方法时，应考虑实验的要求一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。,第三节 核酸分子杂交的类型,固相杂交菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）斑点杂交（D
11、ot blot） Southern印迹杂交（ southern blot ）Northern印迹杂交（Northern blot）组织原位杂交（Tissue in situ hybridization） 液相杂交,固相支持物应具备的特点：,1) 具有较强的结合核酸分子的能力（10 g/ cm2 ） 2) 与核酸结合后，不影响其与探针分子的杂交反应。 3) 与核酸稳定牢固结合，能经受杂交、洗膜等操作过程。 4) 非特异性吸附少。 5) 具有良好的机械性能，如柔软性，柔韧性。,1、固相杂交支持物的选择,几种常用固相支持物,1)硝酸纤维素虑膜（nitrocellulose filter membra
12、ne）具有较强吸附单链DNA和RNA的能力（高盐下达 80 g/ cm2 100 g/ cm2 ）。 真空烘干后，依靠疏水性相互作用。 杂交本底较低。 不易反复杂交和洗膜（结合力） 质地较脆，烘烤后更甚，小心操作 与核酸结合依赖高盐，低盐结合不佳，不易核酸电转,2) 尼龙膜（nylon membrane）结合单链DNA和RNA的能力比NC膜强（达 350 g/cm2 500 g/ cm2 ）。 真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射后,部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。 微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、DNA变性与固定一步完成（菌落原位杂交）。韧性较强，操作方便。能结合
13、小分子核酸。低盐也能很好结合（可用于核酸电转移）。可反复杂交和洗膜。 杂交本底较高,2、固相杂交的一般程序,流程 1.DNA的变性 2.变性的DNA在硝酸纤维薄膜上的固定 3.预杂交 4.杂交 5.洗膜 6.检测,菌落原位杂交 （Colony in situ hybridization）,菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。,3、固相核酸分子杂交类型,斑点杂交（Dot blot）斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量
14、分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如Minifold I和II、Bio-Dot (Bio Rad )和Hybri Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。,Southern 印迹杂交,1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。,流程 1.将核酸分子酶切成为多个片段 2.变性电泳（或者电泳之后变性），使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片段转移到固相支持物上
15、4.预杂交杂交 5.洗膜 6.检测,流程 1.将核酸分子酶切成为多个片段 2.变性电泳（或者电泳之后变性），使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片段转移到固相支持物上 4.预杂交杂交 5.洗膜 6.检测,Northern 印迹杂交,检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性,组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。 原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此,原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。 原位杂交还是显
16、示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。,组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）,第四节 蛋白质分子杂交,自从1975年苏格兰爱丁堡大学Southern EM 首先提出DNA的印迹术（Southern Blotting)以来，给后人许多的启示，1977年Alwine将此技术应用于RNA的研究Nouthern Blotting。1979年，Towbin等人首先将印迹术引入对抗原（蛋白质）的检测Immunoblotting，Western blotting。,WESTERN BLOTTING,其基本过程为：（1）首先做蛋白质的SDS-PAGE电泳。 （2）然后将凝胶中的蛋白质电转印到固相膜上。 （3）在膜上以相应的抗体进行抗原抗体反应。 （4）显色。本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏特异的特点，能从混杂的蛋白质中检测出特定的抗原。,转膜,Protein,HRP,DAB H2O2,1Ab,2Ab,洗膜、显色,
