1、蛋白穿越重现之旅 Western Blot技术 Western Blot 的起源和应用及原理 Western Blot 实验流程详解 Western Blot 实验中的常见问题分析 Western Blot 的起源、应用及原理 Western Blot 实验流程详解 Western Blot 实验中的常见问题分析Western Blot 起源 Renart, J., J. Reiser, G. R. Stark, (1979). “Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with an
2、tisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.“ Proc Natl Acad Sci U S A 76(7): 3116-20. DNA 杂交技术，Southern Blot RNA 杂交技术，Northern Blot 蛋白质印迹技术，Western Blot Western Blot 的应用 定性或半定量分析目的蛋白的特异性 表达 蛋白- 蛋白、蛋白-DNA 和蛋白-RNA 相互 作用的 后续 分析 蛋白修饰的鉴定（磷酸化、糖基化的 鉴定）Western Blot 实验原理 直接法 间接法
3、 Western Blot 的起源和应用 Western Blot 实验流程详解 Western Blot 实验中的常见问题分析Weatern Blot 实验流程 样品制备及定量 SDS-PAGE 转膜 抗体杂交 显色发光 封闭 Western Blot 的起源和应用 Western Blot 实验流程详解 样品制备及定量 SDS-PAGE 电泳 转膜 封闭 抗体杂交 显色 Western Blot 实验中的常见问题分析样品制备 总体原则 整个提取过程在低温下进行，保持蛋白处于溶解状态， 防止蛋白变性、降解与修饰。 根据实验目的选取不同抽提液和抽提方法。 有时需要去除体系中的核酸、无关 蛋白等
4、 干扰成 分 方法简便，耗时短，易于操作。 制备好的样品若不立即使用，需分装冻存于-80冰箱， 及防止储存过程中降解。样品制备方法简介 培养细胞的裂解 组织细胞的裂解 弃细胞培养基 1PBS洗涤 加入细胞裂解液 冰上裂解细胞 离心收集上清 冰上分离目的组织 液氮研磨 加入细胞裂解液 冰上裂解组织细胞 离心收集上清细胞裂解液 组分 作用 举例 缓冲液 提供一定pH 范围的缓冲体系， 使蛋白 保持稳 定，增加溶解度。 Tris-HCl （pH7.5 ） Hepes-KOH （pH7.5 ） 盐离子 保持蛋白在低渗条件下， 避免聚 集沉淀 。 NaCl 螯合剂 螯合金属离子，防止蛋白 提取物 过于黏
5、 稠，溶 解度下降。 EDTA EGTA 还原剂 保护二硫键，防止蛋白发 生氧化 。 DTT -ME 去垢剂 溶解膜与脂膜，溶解与稳 定蛋白 质( 特别是 膜 蛋白) 。 阴离子型：SDS 阳离子型：脱氧胆酸钠 非离子型： NP-40, Tween-20, Triton-X-100 蛋白酶抑制剂 抑制蛋白酶活性，防止蛋 白降解 。 PMSF Aprotinin Leupeptin Pepstetine A 磷酸酶抑制剂 抑制磷酸 酶活性 ， 保持蛋白 样品的 磷 酸化状态 。 Sodium Flouride Sodium Orthovanadate蛋白定量 目的：保持不同处理样品间上样量一 致
6、，便 于分 析结果。 蛋白电泳上样量 细胞样品一般10-20 ug 组织样品一般20-40 ug常用蛋白定量方法 定量方法 原理 灵敏度 干扰因素 标准曲线 Lowry 法 （Folin- 酚法） 在碱性条件下， 蛋 白质与铜作用生成 复合物， 后者将磷 钼酸- 磷钨酸还原成 蓝色复合物。 较高 约5 g/ m l 适用于脂类含量较高的样品 ， 也能耐受相当浓度的去垢剂 （如SDS）； 专一性差， 干扰物质多， 可 受硫酸铵、Tris 缓冲液 、 甘 氨酸、各种硫醇的干扰。 不是严格 的直线 Bradford 法 （考马斯 亮蓝法） 在酸性条件下， 考 马斯亮蓝G-250 和蛋 白质结合产生特
7、殊 的蓝色。 高 约1 5 g/ m l 易受强碱性缓冲 液、TritonX- 100、SDS等去污剂的影响。 线性较差 BCA 法 在碱性条件下， 蛋 白质中的肽键将 Cu 2+ 还原成Cu + ， 后 者能够与BCA 形成 紫色化合物。 很高 0. 5 20 g/ m l 抗干扰能力强， 不受较高浓 度去污剂的干扰； 易受某些还原剂（ 如DTT 和 -ME ） 、 铜离子螯合剂和高 浓度缓冲液的影响。 线性关系 较好 Western Blot 的起源和应用 Western Blot 实验流程详解 样品制备及定量 SDS-PAGE电泳 转膜 封闭 抗体杂交 显色 Western Blot 实
8、验中的常见问题分析SDS-PAGE电泳 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE原理 SDS 的作用SDS-PAGE 电泳使得蛋白混合物能按照各自的分子量大小 分离开来。聚丙烯酰胺凝胶 凝胶的多孔性取决于链的长度以及聚合反应过程交联的程度。 聚丙烯酰胺凝胶具有一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质，用这种 凝胶作为支持物的电泳，就称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 组分 作用 丙烯酰胺 丙烯酰胺单体在自由基的引 发下聚合为长链 N,N- 亚甲双丙烯酰胺 使长链交联起来形成三维网 状结构的凝胶 过硫酸铵（AP） 提供可以引发
9、丙烯酰胺和双 丙烯酰胺聚合的自由基 TEMED 通过催化过硫酸铵形成自由 基而加速丙烯酰胺和双丙烯 酰胺的聚合SDS-PAGE凝胶的有效分离范围 注：丙烯酰胺: 双丙烯酰胺的分子比是1:29 。 丙烯酰胺浓度 / % 线性分离范围 / kDa 15 10-43 12 12-60 10 20-80 7.5 36-94 5.0 57-212连续电泳和不连续电泳 PAGE 根据是否具有浓缩效应 ，分为 连续电 泳和不 连续电 泳两类 。 目前最常用的是不连续电 泳。关于Tricine-SDS-PAGE 小分子蛋白在常规SDS-PAGE 体系中不能得 到良好分辨率 在Glycine-SDS-PAGE
10、中，低分子量的多肽常常堆积在 浓缩胶中，不能进入到分离胶中。 SDS- 多肽胶束大致上是一个球形，而不是通常的椭 圆棒状结构，其长短轴相似。 多肽内部的电荷较高，不能被表面SDS 所带的电荷完 全覆盖，使得迁移率不与分子量呈线性关系。甚至 分子量小于6 kDa 的蛋白，都具有相同的迁移率。 Tricine-SDS-PAGE 适合分离小于30 kDa 的蛋 白，尤其适合疏水蛋白质。 Western Blot 的起源和应用 Western Blot 实验流程详解 样品制备及定量 SDS-PAGE 电泳 转膜 封闭 抗体杂交 显色 Western Blot 实验中的常见问题分析膜选择的依据 膜与目的
11、蛋白分子的结合能力（单位面积的膜能结合蛋白 的载量） 膜的孔径（可拦截蛋白的大小） 分子量大于20kD- 0.45 um 分子量小于20kD- 0.2 um 分子量小于7kD- 0.1 um 是否适合用于所选的显色方法，信噪比高 根据不同的实验目的来选择两种主要膜的对比 NC 膜 PVDF膜 灵敏度和分辨率 高 高 背景 低 低 结合能力 80- 100 ug/cm2 100- 300 ug/cm2 结合强度 低 高 材料质地 纯的NC 膜比较脆 机械强度高 化学兼容性 低 高 是否需要活化 不需要 需要无水甲醇活化 适用范围 化学发光 荧光检测 常规染色 化学发光 常规染色 考马斯亮蓝染色
12、蛋白质测序 糖蛋白检测 二次免疫检测转膜的方法 湿法 半干法转膜注意事项 根据蛋白分子量选择转膜方法 一般的蛋白，两种方法都可以 得到满 意的效 果； 小分子量蛋白，用半干法转膜效果好 ； 大分子量蛋白（如100 kD以上），建议用湿法转膜 。 转膜效果的判断 观察预染Marker 是否全部转到膜上； 丽春红S （Ponceau S）染色 -可逆 。 Western Blot 的起源和应用 Western Blot 实验流程详解 样品制备及定量 SDS-PAGE 电泳 转膜 封闭 抗体杂交 显色 Western Blot 实验中的常见问题分析封闭 目的：将膜上未结合蛋白的区域（也 就是潜 在的
13、 抗体非特异性结合位点）封闭，以避 免产生 非特 异性背景。 封闭剂：5% 脱脂奶粉或BSA 特殊情况不能选择脱脂奶粉： 不能与生物素化或伴刀豆 蛋白标 记的抗 体一起 使用； 不能用于磷酸化抗体对蛋 白磷酸 化的检 测； 不能用于碱性磷酸酶（AP ）显 色方法 。 Western Blot 的起源和应用 Western Blot 实验流程详解 样品制备及定量 SDS-PAGE 电泳 转膜 封闭 抗体杂交 显色 Western Blot 实验中的常见问题分析抗体种类 一抗：第一抗体，能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白， 包括单克隆抗体和多克隆抗体。 二抗：第二抗体，能和抗体结合，即抗体的抗体，其
14、主要 作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。 一般二抗都会偶联可以检测的标记（如荧光、放射性、化 学发光或显色基团），用来检测一抗。 如果一抗本身偶联有这些标记，则不需要二抗，即所谓的 直接WB 。一抗的选择 单克隆抗体 & 多克隆抗体 抗体类别 单克隆抗体 多克隆抗体 抗原类别 多肽 / 蛋白 多肽 / 蛋白 特异性 高 较低 批次间是否一致 完全一致 不能保证 最适应用范围 WB / IP / ELISA / IF / ICC / IHC / FCM WB / IP / ELISA 关于一抗的宿主物种 产生一抗的物种尽量不要 与待检 样品的 物种一 样，以 免二抗 与待 检样品和中的内源性
15、免疫 球蛋白 产生交 叉反应 。例如 ：尽量 不要 用鼠源一抗检测大鼠或小 鼠来源 的样本 。 如果用偶联一抗（直接法）进行检测 ，则无 需考虑 以上因 素。标签抗体和内参抗体 标签抗体 选择标签抗体，在于其通用性。 内参抗体 选择内参抗体，便于校正系统误差，准确判定待测蛋白 表达水平的差异，同时可监测整个WB 过程的准确性。 protein tag选择合适的内参 根据目的蛋白种属来源选 择 哺乳动物： GAPDH, -actin ，-tublin 植物：Plant actin、Rubisco 根据目的蛋白分子量大小 选择 一般同内参相差5 kDa 当两者相差很大时，可以剪膜 当两者相差很小时
16、，可以分别检测-应尽量 避免 根据目的蛋白的定位选择 核定位蛋白：Lamin B ，TBP ， Histone H3 ，PCNA 膜定位蛋白： Na,K ATPase 线粒体定位蛋白： VDAC1, COX IV 胞质定位蛋白: GAPDH, -actin ，-tublin （同样适用于全细胞样品检测） 根据内参的丰度、异构体 以及具 体实验 目的选 择 -actin 在肌肉组织中含量很少 所谓的组织特异性有可能是不同公司 所用抗 原不同 造成的 ： -actin 有N- 和C- 抗原的 区别 凋亡检测时，不适宜选择Lamin B 、TBP 等作为内参。选择正确的二抗 根据一抗的种属来源选择二
17、抗 比如：一抗来自鼠源（如：anti-V5 mouse monoclonal antibody)，二抗 就要用抗鼠二抗（如：Goat anti-mouse IgG (H+L), HRP conjugated)。 根据一抗的类型选择二抗 根据单体数量和重链类型，将抗体分 别为IgA, IgD, IgE, IgG 和IgM 物种同 型或类。 其中又可分为几个亚类：IgA1-2, IgG1a, 2a, 2b, 3，IgM1-2 。 一抗类型 二抗 小鼠IgG 抗小鼠IgG 抗体 小鼠IgG1 抗小鼠IgG1 抗体 抗小鼠IgG 抗体 小鼠IgM 抗小鼠IgM抗体 二抗的偶联标记 酶标二抗（辣根过氧化
18、物酶HRP ，碱性磷酸酶AP ）- WB ，ELISA ， IHC 荧光二抗 生物素标记二抗 Western Blot 的起源和应用 Western Blot 实验流程详解 样品制备及定量 SDS-PAGE 电泳 转膜 封闭 抗体杂交 显色 Western Blot 实验中的常见问题分析显色 HRP AP 底物 发光底物 Luminol AMPPD 显色底物 DAB, TMB, 4-CN NBT, BCIP, NBT/BCIP 特异性 高 低 灵敏度 化学发光 高 高 化学显色 较高 高 背景 低 较高 动力学特性 快 慢 限制因素 叠氮钠抑制HRP活性 内源碱性磷酸酶活性干扰检测 价格 便宜
19、 昂贵 Western Blot 的起源和应用及原理 Western Blot 实验流程详解 Western Blot 实验中的常见问题分 析现象 原因 解决方案 转膜失败（转膜后观察） 1. 看不到预染Marker 电极插反了 从头再来 2. 转膜不充分 （预染Marker有很多 没转过去） a. 转膜时间太短 对于大分子量蛋白或厚胶需要延长转膜时 间 b. 膜未经充分浸润 平衡（不均匀转移） 充分润湿PVDF膜（甲醇）或NC 膜（转移 缓冲液）（蛋白无法与干的PVDF膜结合） 3. 过转 （预染Marker透膜） a. 膜的孔径不合适 选择合适孔径的膜（0.2 um 或更小） b. 转膜电
20、压太高或 时间过长 降低电压或减少时间 c. 蛋白与膜的结合 不强 采用PVDF膜或尼龙膜（结合能力更强） 常见问题分析背景太高现象 原因 解决方案 ECL显影有问题或者失败 1. 背景太高 a. 封闭不彻底 a1. 延长封闭时间（4过夜） a2. 若室温封闭，最好摇床孵育。 a3. 增加封闭蛋白（如BSA ）的浓度 a4. 更换封闭液种类：脱脂奶粉与一些二抗可能有 交叉反应，可更换成BSA b. 抗体浓度过高 增加抗体稀释倍数 c. 洗膜不彻底 c1. 少量多次洗涤 c2. 适当增加去垢剂强度，如Tween-20换成NP-40。 （抗体稀释液中加入Tween-20有助于降低非特异性 结合）
21、d. 蛋白上样量太高 减少蛋白上样量，或增加抗体稀释倍数 e. 转膜缓冲液中 SDS量太高 降低SDS用量没有信号 信号很弱现象 原因 解决方案 ECL显影有问题或者失败 2. 没有信号或信号太弱 a. 蛋白上样量过低 增加蛋白上样量，必要时浓缩样品 b. 抗体浓度过低 增加抗体浓度，或者延长抗体孵育 时间 c. 转膜失败 参见上述“转膜失败”的解决方案 d. 抗体失效 d1. 避免抗体在常温放置过久，避免 反复冻融 d2. 不要用叠氮钠作为HRP 偶联二抗 的抑菌剂 f. 抗原表位破坏 样品制备和转膜过程保持低温，防 止蛋白降解 g. HRP 抗体浓度过高导 致底物迅速耗竭 增加抗体稀释倍数
22、 h. ECL 显色液活性降低 ECL 显色液需现用现配反影 空斑 非特异性条带，斑点现象 原因 解决方案 ECL显影有问题或者失败 3. 反影或条带为黄色 抗体浓度过高 增加抗体稀释倍数 4. 显色条带中有白色未显 影空斑 a. 膜未充分浸润平衡 用缓冲液或甲醇充分浸润膜 b. 转膜时膜与胶之间 有气泡 仔细操作，赶走气泡 c. 显色后包保鲜膜时 有气泡 仔细操作，赶走气泡 5. 非特异性条带多 a. 封闭不彻底 4封闭过夜 b. 抗体特异性不强 增加抗体稀释倍数，或更换抗体 6. 显影后有很多斑点 封闭液有杂质 配好奶粉之后静置一段时间，使较 大的颗粒沉淀下来条带太宽 垂直纹理 “微笑”条
23、带 “皱眉”条带现象 原因 解决方案 ECL 显影有问题或者失败 10. “ 微笑”条 带 a. 条带迁移过快 降低电压，减慢电泳速度 b. 电泳温度过高 降低电压，低温电泳 c. 凝胶中间凝固不均匀，多见于 厚胶 待凝胶充分凝固再电泳 11. “ 皱眉”条 带 凝胶与玻璃挡板底部有气泡 在两板间加入适量缓冲液以排除气泡 12. 垂直纹理 a. 样品中有不溶性颗粒 a1. 加样前离心 a2. 优化蛋白提取方法，寻找合适的 裂 解液 b. 凝胶中有小气泡 仔细配胶，赶走气泡 13. 条带太宽 样品盐离子浓度过高 调整裂解液的盐浓度条带扭曲 条带太粗 拖尾现象 原因 解决方案 ECL显影有问题或者
24、失败 7. 条带扭曲 a. 分离胶与浓缩胶界面不平 做好分离胶后注意立即封胶 b. 蛋白溶解度不好 优化蛋白提取方法，寻找合适的裂解 液 c. 体系中盐离子浓度过高 优化蛋白提取方法，寻找合适的裂解 液 8. 条带太粗 浓缩胶配制出错，没有浓缩效应 1. 检查pH 值，重新配制浓缩胶 2. 适当增加浓缩胶长度 3. 降低电压，延长电泳时间 9. 拖尾 a. 蛋白样品溶解度不好 a1. 加样前离心 a2. 优化蛋白提取方法，寻找合适的 裂解液 b. 电泳缓冲液重复利用次数过 多 重新配制电泳缓冲液 c. 分离胶浓度过大 降低凝胶浓度其它问题分析 显色后目的蛋白分子量同预期不一致 蛋白翻译后修饰：
25、糖基化，磷酸化，羟基化 蛋白含有特殊氨基酸组成 含有较多碱性氨基酸会使 迁移率 降低： 如溶菌 酶 含有较多酸性氨基酸会使 迁移率 增加 蛋白上样量太多，有时会导致条带下移，需要减少上 样量判断准确位置 电泳染色后加样孔底部或浓 缩胶与分离胶界面处有条带 多发生于大分子量蛋白分析中 解决办法 加热煮沸后，添加适量的DTT 或 -ME ，以补充不足的 还原剂 。 煮样时添加适量EDTA 以阻 止还 原剂的氧化。 Strip 当需要用不同抗体对同一张膜进行杂交时，需要做Strip 处理。 配方： 100mM 2-mercaptoethanol 2% SDS 62.5mM Tris (pH6.7)
26、55水浴30min如何保证WB 的成功 蛋白制备是关键 配胶不可小觑-细节决定成败 凝胶时间要足够长，保证 充分交 联。 上样前，用电泳缓冲液清洗梳孔 各泳道蛋白样品上样量保持一致 用1Loading Buffer 将各泳道上样量调成一致 条件允许时，可以低电压跑浓缩胶，再调高电压跑分离胶 封闭和洗膜要充分 一抗和二抗的浓度要优化好 科学的设置阳性对照和阴性对照公司现有产品介绍 蛋白样品制备与定量 ProteinIso TM Ni-NTA Resin ProteinIso TM Ni-IDA Resin ProteinIso TM GST Resin ProteinIso TM Protein A Resin ProteinIso TM Protein G Resin Easy Protein Quantitative Kit Easy II Protein Quantitative Kit (BCA) 6Protein Loading Buffer 上样电泳 Pre-Stained Protein Marker Western Protein Marker Pre-made SDS Protein Gel 常用抗体 一抗 标签抗体 内参抗体 二抗 HRP 偶联二抗 显色 EasySee TM Western Blot KitTHANK YOU!
