1、生物分离的前处理 发酵液的预处理,E. coli,生化分离工程,2.发酵液的预处理,2.1 发酵液的特性和预处理的目的 2.2 预处理加热 2.3 预处理调节pH值 2.4 预处理加入助滤剂 2.5 预处理加入反应剂 2.6 预处理凝聚 2.7 预处理絮凝,2.1 发酵液的特性和预处理的目的,无论产物在胞内还是在胞外或是菌体本身，都首先需要进行发酵液的预处理和固液分离，以使产品可以从澄清的发酵液中提取，或是从收集的固体（菌体）进行破碎、提取分离胞内的产物。,intracellular：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质 等 extracellular：抗生素（青霉素、红霉素）、有机酸（柠檬
2、酸、乳酸）、胞外酶（-淀粉酶）等,微生物发酵液的特性：发酵产物浓度较低，大多为110，有的甚至更低，悬浮液中大部分是水； 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大； 固体粒子可压缩性大； 经常含有一些粘性物质，如蛋白质、核酸和多糖等，液相粘度大，大多为非牛顿型流体； 性质不稳定且随时间变化，如易受微生物污染、空气氧化、蛋白酶水解等作用的影响。这些性质使得发酵液的过滤与分离相当困难!,工业生物技术中典型固相的形态（非标尺）,表 工业生物技术中典型的固体粒子,预处理的目的改变发酵液的物理性质(黏度、颗粒、颗粒稳定性等)，固液分离速度 ，分离器分离效率 ； 目标产物转移其中一相(多数为液相)； 去杂质,
3、发酵液预处理的主要方法,2.2 加热一般加热的温度采用6580。不同的蛋白质其开始变性沉淀的温度不同。最简单也是最廉价的发酵液预处理方法。通过对发酵液进行加热处理可以达到几个目的： 降低发酵液粘度，改善固液分离条件； 除去部分热敏性的杂质，如杂蛋白；同时，在适当温度和受热时间下可使发酵液中的蛋白质由于变性而凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，发酵液的粘度就会随之降低，进一步改善了发酵液的过滤特性。 使发酵液获得巴氏灭菌的作用。前提是目的产物必须为非热敏性的。,缺点：热处理常常会对发酵液质量有些影响，特别是会使色素增多。而且，温度升高常使发酵液中的一些水解酶活力升高，被分离产物有受酶水解的危险。因此，热
4、变性最好在硫酸铵溶液中进行，另外，选择合适的缓冲液、pH、加热方式和加热过程也很重要。,新进展：为了提高产物在下游提取过程中的活力稳定性，人们对耐高温型的基因工程产品（如蛋白酶等）的关注也日益加强，不断有耐高温的基因工程产品出现，这也使得采用升高温度的处理方法可行性和可操作性更强。而且，原来为了防止产品失活（需要控制在低温条件下操作）而消耗的制冷能耗也可以节省，并简化了分离步骤。,嗜热微生物产生的高温酶,极端微生物,海底火山口100多,2.3 调节pH值适当的pH值可以提高产物的稳定性，减少其在随后的分离纯化过程中的损失。例如，在毕赤酵母表达体系中，由于毕赤酵母分泌的蛋白酶会分解表达的基因蛋白
5、，所需蛋白的收率受到很大的影响，如果调整pH至酸性则可有效抑制蛋白酶的活性，目的蛋白的收率能够增加。注意：你的蛋白在这个pH下是否稳定？,Pichia pastoris,大多数蛋白质在pH59范围内比较稳定，超出这个范围就可能会发生变性。酸和碱都能使蛋白质发生变性（可逆变性或不可逆变性），在温和条件下为可逆变性，在强酸、强碱条件下则为不可逆变性。这是因为蛋白质是氨基酸聚合物，在肽链的不同部位上带有不同电荷的基团，这些基团之间静电引力形成的键维持着天然蛋白分子的构象。酸和碱的作用，使蛋白质分子内的基团带电性质发生变化，从而破坏了静电引力所形成的键，同性相斥的结果使原来的构象发生了变化。,蛋白质p
6、H变性的速度与蛋白质分子质子化（或非质子化）的速度无关，它取决于该蛋白质结构趋向松散的速度。因此温度也是一个重要的影响因素，pH变性时的温度一般控制在010之间。pH变性比热变性更安全可靠，它能迅速达到或偏离特定的pH值，放大操作很方便。在调节pH值时要注意，应选择比较温和的酸和碱，以防止局部过酸或过碱。调节pH58.8范围常用Tris和醋酸，调节pH4.0左右常用乳酸，更低的pH可用磷酸或硫酸；草酸也是一种较常用的酸性pH值调节剂。调节pH9.0左右可用二乙胺，调节pH9.5左右用碳酸钠，更高的pH值可用氢氧化钠或氢氧化钾。,2.4 加入助滤剂助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，在发酵液中添加助
7、滤剂后能使滤饼疏松，滤速增大。这是因为使用助滤剂后，悬浮液中大量的细微粒子被吸附到助滤剂的表面上，从而改变了滤饼结构，形成更多的可透过通道，它的可压缩性下降了，过滤阻力降低了。助滤剂尤其适用于处理具有菌丝体的发酵液。,常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、碳粒、磨碎木浆、淀粉等。助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤介质表面预涂助滤剂，另一种是将其直接加入发酵液，也可两种方法同时使用。,选择和使用助滤剂需要注意几点： （1）根据目的产物选择助滤剂品种 当目的产物为液相时，要注意目的产物是否会被助滤剂吸附，这种吸附常与pH有关；当目的产物为固相时，一般使用淀粉、纤维素等不影响产品质量
8、的助滤剂。 （2）根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂的种类 当使用粗目滤网时，采用石棉粉，淀粉，纤维素等可以有效地防止泄漏。当使用细目滤网时，应采用细颗粒的硅藻土，如用大颗粒的硅藻土，则悬浮液中的细小固体可能会穿过硅藻土到达滤布表面从而使过滤阻力增大；当使用烧结或粘结材料过滤介质时，宜使用纤维素助滤剂，这样可使滤渣易于剥离并可防止堵塞毛细管。,（3）粒度选择 助滤剂的粒度及粒度分布对过滤速率和滤液澄清度影响很大。当粒度一定时，过滤速率与澄清度成反比，过滤速率大，澄清度差；过滤速率小，则澄清度好。助滤剂的粒度必须与悬浮液中固体粒子的尺寸相适应，颗粒较小的悬浮液应采用较细的助滤剂。商品硅藻土助滤剂有
9、多种规格，粒度分布不同。使用前应针对不同的发酵液和过滤要求，通过实验确定其最佳型号。,（4）使用量的选择 助滤剂的使用量必须合适。使用量过少，起不到有效的作用；使用量过大，不仅浪费，而且会因助滤剂成为主要的滤饼阻力而使过滤速率下降。当采用预涂助滤剂的方法时，间歇操作助滤剂的最小厚度为12mm；连续操作则要根据所需过滤速率来确定。当助滤剂直接加入发酵液时，一般情况下，若助滤剂用量与悬浮液中固形物含量相等，过滤速率最快。,2.5 加入反应剂主要目的： 选择性沉淀所需的产品； 通过反应除去某些杂质； 改善发酵液的流体特性。,生物下游技术中也大量利用化学反应来达到选择性分离纯化或产品制造的目的。可以通
10、过加入无机盐，使产物生成不易溶解的形式加以分离。如柠檬酸工业中常用CaCO3或石灰乳与柠檬酸反应生成溶解度很低的柠檬酸钙盐沉淀，以便于与发酵液中残糖及其他可溶性杂质分离开，使产物得到浓缩和初步纯化。发酵液中的高价无机离子主要是Ca2+、Mg2+、Fe3+等。通常利用草酸与Ca2+反应，生成不溶性的钙盐的性质可除去杂质Ca2+。加入三聚磷酸钠与Mg2+形成络合物。对于铁离子，可加入黄血盐使之形成普鲁士蓝沉淀而除去。ZnSO4和黄血盐也常用来去除杂氨基酸和杂蛋白。正确选择反应剂和反应条件，能使过滤速率提高3-10倍。,加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生
11、成的沉淀又能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身即可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。如在新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成的磷酸钙沉淀可充当助滤剂，使过滤性能得到改善。,有时，加入某些不影响目的产物的反应剂，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速率。如发酵液中含有可溶性或不溶性多糖物质，则最好用酶将它转化为单糖，以提高过滤速率。例如，万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025的淀粉酶，搅拌30min后（水解未消耗完的淀粉颗粒），再加2.5硅藻土助滤剂，从而可使过滤速率提高5倍。另外，在一些发酵液中加入多糖水解酶以降解发酵过程中产生的粘
12、性多糖，能使发酵液的粘度大幅降低，过滤速度得以提高。,2.6 凝聚凝聚和絮凝，这两种方法均是在发酵液中添加一定的试剂，使菌体或蛋白形成较大絮凝团，悬浮颗粒尺寸增大以利于后续固液分离操作。这两种方法在生物发酵液的预处理中使用也越来越多。这两种方法在机理和应用上有所不同，但人们经常将其混淆。,凝聚凝聚是发酵液预处理的重要方法，其处理过程是将凝聚剂加入到发酵液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，促使其聚集成大的、易分离的凝聚体。,表2 体系按颗粒大小的分类,2.6.1 发酵液中固体颗粒的性质发酵液中需利用凝聚作用进行分离的对象为菌体或蛋白质等，它们在溶液中以胶体粒子或悬浮物
13、颗粒形式存在，颗粒的大小分类见上页表2。胶体和悬浮物由于布朗（Brown）运动，会使颗粒间互相碰撞，在同样条件下，较小的颗粒运动速度较快，碰撞机会多，因此会导致小颗粒集结成大颗粒，最后产生凝聚沉淀。温度提高，可使胶体产生凝聚沉淀，原因就在于温度提高时，颗粒的能量增加，运动加快，颗粒间碰撞的机会更多。胶体和悬浮物颗粒的另一个特点是颗粒表面都带有电荷，这是胶体和悬浮物颗粒在溶液中得以稳定的主要因素之，颗粒表面所带电荷的数量对凝聚作用有很大的影响。,2.6.2 凝聚过程的机理通常情况下，发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面都带有负电荷，由于静电作用，使溶液带相反电荷的阳离子被吸附在其周围，在
14、界面上形成双电层。胶粒能保持分散状态的原因主要是带有相同电荷和扩散双电层的结构，一旦由于布朗运动使粒子间距离缩小到它们的扩散层部分重叠时，即产生电排斥作用，使两个粒子分开，从而阻止了粒子的聚集。,图2 胶体双电层的构造,对带负电性菌体的发酵液，向其中加入某种电解质，在电解质中异电离子(阳离子)作用下，可压缩扩散层的厚度，促使电位迅速降低，而且，化合价越高，这种影响越显著，当双电层的排斥力不足以抗衡胶粒间的范德华引力时，由于热运动的结果导致胶粒的互相碰撞而聚集起来。阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚能力的次序为： Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+。从上面的理论可以看出，胶体
15、结构中的双电层受压缩变薄时，会降低电位，当电位降低到相当小时，颗粒就会因互相吸引而产生疏松的絮凝体。电解质可以中和颗粒表面的电荷而压缩胶体中的双电层。但如果双电层的压缩不能大量地减少胶体颗粒表面的电荷，因此产生的疏松的絮凝体容易在物理因素的作用下重新分散。,2.6.3常用的凝聚剂常用的凝聚剂见表3，可以看到，常用的凝聚剂主要都是一些无机盐电解质。,表3 常用凝聚剂种类,2.7 絮凝2.7.1絮凝过程的机理絮凝技术和凝聚一样，都能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体分子的分散状态，使其聚集起来，颗粒体积增大，以便于过滤，常用于菌体细小而且粘度较大的发酵液的预处理中。除此之外，还能有效除去杂蛋白质和
16、固体杂质，提高滤液质量，对产品起到初步纯化作用。但二者的作用机理却有不同，絮凝和凝聚的概念应加以区分。凝聚是指胶体及悬浮物颗粒表面电荷被中和，静电排斥力消失，颗粒脱稳而形成细小的凝聚体的过程。而絮凝是指在某些高分子絮凝剂的存在下，基于架桥作用，使胶粒形成较大絮团的过程。是一种以物理的集合为主的过程。絮凝作用的过程首先包含着凝聚的作用，因此现在多数人都认为絮凝作用的机理是凝聚和絮凝两种作用的结果。可以认为凝聚作用是颗粒由小到大的量变过程，而絮凝作用是若干个凝聚作用的结果，当颗粒聚集到一定程度时，便会从溶液中沉降而分离出来。,近年来，发展了不少种类的有机高分子聚合物絮凝剂，它们具有长链线状的结构，
17、是一种水溶性的聚合物，分子量可高达数万至一千万以上，在长的链节上含有相当多的活性功能团，可以带有多价电荷（如阴离子或阳离子），也可以不带电性（如非离子型）。它们通过静电引力、范德华力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面，一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同胶粒的表面上，产生了架桥联接，生成粗大的絮团，这就是絮凝作用。高分子絮凝剂的混和、吸附和絮凝作用见示意图3。凝絮过程中的架桥作用是指溶液中胶体和悬浮物颗粒通过有机或无机高分子絮凝利吸附，形成架桥式空间结构的絮凝体而沉淀下来的现象。有时候也可能是两个同性电荷的胶体颗粒与两个带异电性的小颗粒连结在一起。,图3 高分子絮凝剂的混合、吸附和絮凝作
18、用示意图,（a）聚合物分子在液相中分散、均匀分布在粒子之间；（b）聚合物分子链在粒子表面的吸附；（c）被吸附链的重排，高分子链包围在胶粒表面，产生保护作用，是架桥作用的平衡构象（d）脱稳粒子互相碰撞，形成架桥絮凝作用；（e）絮团的打碎,对于带负电性菌体或蛋白质来说，阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低粒子排斥电位和产生吸附架桥的双重机理，所以可以单独使用；对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，则主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附架桥，它们常与无机电解质凝聚剂搭配使用。首先加入无机电解质，使悬浮粒子间的相互排斥能降低，脱稳而凝聚成微粒，然后，再加入絮凝剂。无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造
19、了良好的条件，从而，提高了絮凝效果。这种包括凝聚和紫凝机理的过程，常称为混凝。,表4 凝聚与絮凝的差别,2.7.2 常用的絮凝剂目前最常见的高分子聚合物絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）类衍生物，根据活性基团在水中解离情况不同，可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺基）三类。由于聚丙烯酸胺类絮凝剂具有用量少，一般以ppm计量；絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适用范围广。它们的主要缺点是存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，因此，当用于食品及医药工业时，应谨慎使用，要考虑这些物质最终能否从产品中去除。近年来还发展了聚丙烯酸类阴
20、离子絮凝剂，它们无毒，可用于食品和医药工业中。另外。还有聚苯乙烯类衍生物及无机高分子聚合物絮凝剂，如聚会铝盐和聚合铁盐等。除此以外，也可采用天然有机高分子絮凝剂。如多聚糖类胶粘物，海藻酸钠，明胶、骨胶和壳聚糖等。,表5工业上常用的絮凝剂举例,壳聚糖,2.7.3影响絮凝分离的因素絮凝作用是复杂的物理化学过程，影响絮凝作用（过程）的因素也是复杂和多方面的，如：分子量和类型，絮凝剂的加入量、溶液的pH，搅拌转速和时间等。同时，在絮凝过程中，常需加入一定的助凝剂以增强絮凝效果。,1、pH对絮凝作用的影响溶液pH值对絮凝作用的影响是非常大的，pH值的变化常会影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，从而影响分子
21、链的伸展形态。电离度增大，由于链节上相邻离子基团间的静电排斥作用，而使分子链从卷曲状态变为伸展状态，所以架桥能力提高。因此，pH值通过对胶体颗粒表面的带电性（电位）、絮凝剂的性质的改变对絮凝的作用产生很大的影响。一般情况下，阳离子型的絮凝剂适合在酸性和中性的pH值环境中使用；而阴离子型絮凝剂适合在中性和碱性的环境中使用。聚季铵盐的阳离子有机高分子絮凝剂也适合在碱性的介质中使用。非离子型絮凝剂适合于从强酸性到碱性的环境中使用。,2、温度对絮凝作用的影响温度过高或过低都对絮凝不利，一般絮凝作用最适合的温度在2030之间。水温过高时，化学反应速度过快，形成的絮凝体细小，并使絮凝体的水合作用增加，同时
22、能量的消耗也增大。水温过低，有些絮凝剂的水解反应变慢，水解时间过长，效率降低；同时温度低，水的粘度变大，也会增加水对絮凝体的撕裂作用，使絮凝体变得细小，不易分离。,3、搅拌速度和时间对絮凝作用的影响搅拌的速度和时间对发酵液絮凝的影响很大，条件选择得恰当，可以加速絮凝作用，有利于絮凝剂发挥作用，提高絮凝效果。几点结论： （1）絮凝初期，颗粒聚并快，此时搅拌应强一些，絮凝后期，颗粒聚并速度变慢，搅拌应降低。 （2）增加颗粒浓度，有利于聚并絮凝。 （3）加大搅拌，增加速度梯度有利于颗粒聚并，但太大时，剪切力会导致絮凝体破裂。一般来说，搅拌转速以4080r/min为宜，不要超过100r/min；搅拌时
23、间以24min为宜，不超过5min。速度过快，时间过长，会将大颗粒的固体搅碎变成小颗粒而不能沉淀；搅拌速度过慢，时间过短，絮凝剂和胶体颗粒不能充分接触，不利于絮凝剂捕集胶体颗粒，从而难以发挥絮凝作用。,谭天伟，沈忠耀.细胞絮凝技术及在生物产品分离中的应用. 生物工程进展，15(5), 5356 (1995),4、高分子絮凝剂的性质和结构对絮凝作用的影响线型结构的有机高分子絮凝剂，絮凝作用较好。而环状或支链结构的有机高分子絮凝剂的絮凝效果较差。有机高分子絮凝剂的一些官能团如COONa、R3NRCl、CONH2、SO3Na等过多时，电荷密度过高，絮凝作用差；官能团较少时，有利于絮凝作用，但过少对电
24、荷的中和作用不利而影响到絮凝作用。,5、高分子絮凝剂的相对分子量对絮凝作用的影响高分子絮凝剂分子量增大，链增长，可使架桥效果更明显，所以通常情况下，絮凝剂的相对分子量越大，絮凝作用越好。絮凝剂的相对分子量不要小于30000，最好在250000以上。但是，分子量也不能超过一定的限度，因为随分子量提高，高分子絮凝剂的水溶性降低，因此分子量的选择也应适当。,6、絮凝剂的用量对絮凝作用的影响一般情况下，料液中的絮凝剂浓度增加有助于架桥充分，絮凝作用的效果随着絮凝剂用量的增加而增大。絮凝剂的用量达到一定值时，絮凝作用达到最佳效果，但再增加用量时，絮凝效果反而下降，因为絮凝剂过量时会使形成的絮凝体重新变成
25、稳定的胶体。絮凝剂的用量与溶液中悬浮物的含量有关，所以最佳的絮凝剂用量应通过实验来确定。,2.7.4絮凝技术的应用和发展动态絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，提高了滤液质量，在生物产品分离中的应用越来越广泛。Person等曾报导在-半乳糖苷酶（胞内酶）发酵液中采用絮凝技术除去细胞碎片的方法，利用壳聚糖（chitosan）和聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine）阳离子絮凝剂以及氯化钙无机电解质，分别在细胞破碎前后处理发酵液，有机絮凝剂在破碎前预先加入，其加量为 640ppm，氯化钙在破碎后加入，加量为 40
26、 mmol，并调节一定的 pH，这样可将细微的细胞碎片粒子聚集起来。絮凝处理的结果不仅大大改善了离心分离后滤液的澄清度，使细胞碎片的去除率提高了十倍以上，而且凝固了部分可溶性杂蛋白质，滤液总蛋白的含量降低了40，实验还证明，在絮凝过程中，-半乳糖苷酶的活性（U/mL）并没有受到影响。I Persson and B. Lindman. Flocculation of cell debris for improved separation by centrifugation, in flocculation in biotechnology and separation systems， 4574
27、66，Y. A. Attra, ed., Elsevier, Amsterdam, 1987,絮凝技术的一个新方向是亲和絮凝。其利用絮凝剂和细胞膜表面某种成分专一性交联而达到絮凝目的，这就使絮凝技术可以用于特定产物的分离。J. Bonnerjea 利用硼酸盐和酵母表面的多羟基之间的专一性交联作用，除去含有多羟基的酵母细胞碎片，分离回收乙醇脱氢酶，酶收率在90。 J. Bonnerjea et al. Enzyme and Microbial Technology，10，357361，1988C. Senstad 利用壳聚糖和小麦胚凝集素（WGA）之间的亲和性及壳聚糖在高pH（6.5）时絮凝沉淀的特性，达到分离纯化WGA的目的。因此亲和絮凝是一种很有前途的生物产品分离方法。C.Senstad et al. Biotechnology and Bioengineering，34，389393，1989,下一节：第二章 固液分离与细胞破碎,
