1、使用说明书Vazyme biotech co., 网站/Web: 咨询热线/Tel: 400-600-9335销售/Sales: 技术支持/Support: 技术服务/Service: Vazyme Biotech Co., LtdVersion 3.2ClonExpressTMMultiSOne Step Cloning Kit产品概要产品组成 贮藏条件 实验方案 参考实例注意事项常见问题与解决方案 01/02ClonExpressTM快速克隆技术ClonExpressTM技术是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进
2、行线性化，并在插入片段PCR引物5端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5和3最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bpj20 bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在ExnaseTM的催化下，仅需反应30 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。ClonExpressTMMultiS是新一代的重组克隆试剂盒，该试剂盒中包含有专门针对多片段重组反应而优化的反应缓冲液和重组酶ExnaseTMMultiS。使用该试剂盒，可以一次实现多至五个插入片段的顺序拼接克隆。此外，ExnaseTMMultiS
3、还兼容常规酶切、PCR反应体系。克隆载体酶切产物或PCR产物以及插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。产品优点 -简单、快速、高效-适用于向几乎任何载体的任何位点进行多片段拼接克隆-无需考虑插入片段自身携带的酶切位点-可一次实现多至五个插入片段的顺序拼接克隆 -线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆应用范围 -多片段拼接克隆 -全基因合成-DNA定点突变1/产品概要2/产品组成组 分 C113-01 (10 rxn) C113-02 (25 rxn)5 CE MultiS BufferExnaseTMMultiSpUC19 control vec
4、tor, linearized (50 ng/l)Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/l; 1 kb, 20 ng/l; 2 kb, 40 ng/l)40 l20 l5 l5 l100 l50 l5 l5 lCatalog目 录03/044/实验方案4.1 实验流程概览（图一）1).线性化克隆载体制备 (参见4.2)；2).插入片段扩增引物设计 (参见4.3)；3).插入片段PCR扩增 (参见4.4)； 4).进行重组反应 (参见4.5)；5).反应产物转化、涂板 (参见4.6)； 6).克隆鉴定 (参见4.7)。4.2 线性化克隆载体制备选择合适的克隆位点，并
5、对克隆载体进行线性化。我们推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在40%60%范围之内时，重组效率将达到最大。克隆载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化，也可以为反向PCR扩增。A 线性化克隆载体由酶切制备 双酶切线性化：线性化完全，转化背景 (假阳性克隆) 低。推荐使用。单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。ClonExpressTMMultiS 重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。克隆载体酶切产物加热失活内切酶 (参见内切酶使用说明书，例如Hind III，65孵育20 min完全失活) 后可直接
6、用于重组反应。B 线性化克隆载体由反向PCR扩增制备注：ClonExpressTMMultiS 重组反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克隆 (无插入片段) 是由未线性化环状载体转化而形成的。如这种假阳性克隆比例较高，应重新制备线性化克隆载体。 注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 l (重组反应总体积的1/5) 。克隆载体酶切产物或 PCR 扩增产物DNA 纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进
7、行较大片段(5kb) 克隆时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提高 DNA 纯度并去除一部分未线性化的环状载体 ( 电泳位置不同于线性化克隆载体) 。不同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。我们推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增 (PhantaTMSuper-Fidelity DNA Polymerase, Vazyme, P501) 以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。CloneExpressTMMultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板为预线性化质粒且PCR产物电
8、泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。表一：线性化克隆载体的使用方式线性化载体制备方式 快速实验方案 最佳实验方案模板类型PCR制备有明显非特异性扩增环状质粒环状质粒预线性化质粒、基因组、cDNA加热失活内切酶后直接使用扩增特异DpnI 消化后直接使用(降解扩增模板)直接使用酶切消化制备 胶回收胶回收胶回收胶回收或DpnI 消化后胶回收4.3 插入片段扩增引物设计ClonExpressTMMultiS 引物设计总的原则是：通过在引物5端引入同源重组序列，使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序列 (15 bp20 bp)。以pUC18作为
9、克隆载体、进行三插入片段顺序拼接克隆 (5至3按克隆顺序依次为：第一片段、第二片段、第三片段)为例，引物具体设计方案如下：图一：使用ClonExpressTMMultiS进行多片段拼接克隆实验流程用于重组反应的克隆载体必须为线性化载体。该线性化载体可通过内切酶消化环状载体获得，也可由反向PCR扩增环状载体获得 (图，上左)。插入片段由PCR扩增制备。所用扩增引物在设计时需在其5端添加同源重组序列 (图中以深蓝色、深灰色、浅蓝色和红色标记)。使用这些引物分别扩增插入片段，扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的一致序列 (图，上右)。以线性化克隆载体和插入片段扩增产物
10、配制重组反应体系，37反应30 min即可完成重组反应，实现多片段顺序拼接并克隆至目标载体 (图，中)。重组产物直接进行转化，平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选 (图，下)。本产品应置于-20储存。3/贮藏条件05/06图二：第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物设计示意图三：第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物设计示意4.4 插入片段PCR扩增插入片段可用任意PCR酶 (Taq 酶或高保真酶) 扩增，无需考虑产物末端有无A加尾 (重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。我们推荐您使用高保真聚合酶进行扩增(PhantaTMSuper-Fidelity DNA Poly
11、merase, Vazyme, P501)，以减少扩增突变的引入。首先设计第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物(与载体相邻的两个插入片段)，如图二所示其次设计第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物。用于片段之间进行重组的同源序列可以添加至前方片段的反向扩增引物中，也可以添加至后方片段的正向扩增引物中，还可以两片段各添加一部分。以将同源序列添加至前方片段 (第一片段)的反向扩增引物中为例，引物具体设计方案如图三所示：最后设计第二片段的反向扩增引物和第三片段的正反向扩增引物。设计方式与第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物设计方式一致。具体方案参见图三。注：如最终引物长度
12、超过40 bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。注：如最终引物长度超过40 bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。07/08PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。ClonExpressTMMultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组
13、反应。PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段 (5kb) 克隆实验时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方式可查阅表二。注意: 我们推荐您使用转化效率108cfu/g的感受态细胞。如果感受态转化效率5 kb)克隆、使用环状质粒作为扩增模板时、或者当扩增产物不特异时，DNA未纯化直接使用扩增不特异，杂带较多不完全线性化，有环状质粒残留选择带有重复序列，或高GC、高AT区域的区域进行克隆冷却后的反应产物应在1 hr内进行转化，转化之前应一直保持冰水浴低温。如需储存，于-2
14、0进行同源序列少于推荐长度或者添加错误反应完成后立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min在温控比较精确的仪器内 (PCR仪或水浴锅)，37反应30 min载体克隆位点选择在冰水浴中配制；根据实际浓度，按照重组反应所需最适DNA量以及比例配制琼脂糖电泳检测在进行较大片段 ( 95 kb) 克隆时、使用环状质粒作为扩增模板时、当扩增产物不特异时，DNA应进行胶回收纯化实验步骤插入片段引物设计克隆载体线性化插入片段PCR扩增线性化载体/插入片段扩增产物DNA纯化线性化载体/插入片段扩增产物DNA浓度测定重组反应体系配制进行重组反应终止重组反应转化菌落PCR表三：使用ClonExpressTM Mult
15、iS进行重组克隆时主要注意事项下表列出了使用ClonExpressTMMultiS进行重组克隆时主要注意事项 (表三)：6/注意事项1 平板上长不出克隆或克隆数目很少 a).感受态效率低：使用新制备或妥善冻存的感受态细胞，确保转化效率 107cfu/g。每次可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。 b).线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/ 过量，或者比例不佳：尽量按照推荐的量配制反应体系。请务必预先检测线性化克隆载体和插入片段PCR产物的浓度。常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大。因此，我们强烈推荐您
16、通过琼脂糖电泳来测定样品中的DNA浓度 (测定方法参见5/参考实例)。c).载体和插入片段不纯，抑制反应：未纯化DNA加入重组反应体系内的总体积不应超过4 l (反应体系体积1/5)。尝试对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。重组反应体系中应尽量避免金属络合剂 (如EDTA)的带入。因此，我们推荐您将DNA纯化产物溶解在pH8.0的ddH 2O中保存 (常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用pH8.0的ddH 2O替代)，请勿使用TE进行DNA保存。d).感受态细胞中加入了过多的反应产物：反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。e).出现转化抑制效应：当转化的DNA浓
17、度太高时，会抑制转化反应。将重组反应产物稀释5倍后取1/5进行转化。2 多数克隆不含插入片段a).克隆载体线性化不完全：即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的背景。提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物，都可以有效减少甚至消除环状质粒残留。b).反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板 (扩增克隆载体或者扩增插入片段)为环状质粒。当扩增产物直接用于重组反应时，残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。尽量使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI消化、扩增产物进行胶回收纯化，都可以有效减少甚至消除环状模板质粒残留。 3 克隆含有不正确的插入片段a).PCR产物
18、混有非特异扩增产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。b).载体线性化不完全：如果线性化载体不是由空载体酶切或扩增制备，而是由已插入其他不同片段的载体酶切或扩增制备而成，不完全酶切或残留环状模板质粒将导致很高的转化背景，使部分克隆中含有不正确的插入片段。提高酶切效率、使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI消化、扩增产物进行胶回收纯化，都可以有效避免此类情况发生。 4 特别提醒！ 在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游 50 bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游20bp区域内GC含量均在40% 60%范围之内时，重组效率将达到最大。如这部分区域GC含量高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。7/常见问题与解决方案
