1、19.9.3,1,第7章 吸 光 光 度 法,Spectrophotometry,19.9.3,2,7.1光吸收基本定律 7.2 分光光度计 7.3 显色反应及影响因素 7.4 吸光光度分析及误差控制 7.5 吸光光度分析法的应用,19.9.3,3,吸光光度法是基干物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。方法特点: 一、灵敏度高:1%10-5% 二、准确度高:目视5%10%,仪器2%5% 三、快速简便 四、应用广泛:绝大多数无机离子,有机化合物,19.9.3,4,7.1 光吸收基本定律,7.1.1.光的基本性质一、光是一种电磁波 - 波粒二象性,19.9.3,5,2. 微粒性,h普朗克(Pl
2、anck)常数 6.62610-34Js 频率 E光量子具有的能量单位:J(焦耳),eV(电子伏特),光量子,具有能量。,1. 波动性,19.9.3,6,3. 波粒二象性,结论:一定波长的光具有一定的能量,波长越长(频率越低),光量子的能量越低。 单色光:具有相同能量(相同波长)的光。 复合光:具有不同能量(不同波长)的光复合在一起。 电磁波谱的波段如何划分?,真空中:,19.9.3,7,4电磁波谱(Electromagnetic waves),电磁辐射按波长顺序排列:,射线 X 射线紫外光可见光红外光微波无线电波,19.9.3,8,二、光的互补关系,可见光白光(复合光):由不同波长的光按 一
3、定比例复合而成 单色光:波长处于某一范围的光(理论:同一波长)互补光:如果两种单色光按一定强度比例混合后到白光,这两种单色光称为互补色,19.9.3,9,不同颜色的可见光波长及其互补光,19.9.3,10,三、吸收曲线,当白光通过某一有色溶液时,该溶液会选择性 地吸收某些波长(wavelength)的光而让未被吸收 的光透射过,呈现的是它吸收光的互补光的颜色例如,KMnO4溶液选择吸收了白光中的绿色(500560nm)光,与绿色光互补的紫色光因未被吸收而透过溶液,所以KMnO4溶液呈现紫色。,19.9.3,11,将一系列不同波长的单色光依次通过某一吸光物质,测量该物质对光的吸收程度(吸光度),
4、作吸光度(A)入曲线:吸收曲线,吸收曲线:,19.9.3,12,吸收曲线 (absorption spectrum),19.9.3,13,吸收曲线的讨论:,1.在入525nm,吸收最大 入max2. 浓度改变 入max不变 (同种溶液) 浓度越大,吸光度越大,19.9.3,14,7.1.2 光吸收的基本定律,一. 朗伯比尔定律(Lamberts law),透光度(T)与吸光度(A),I0= It+Ia+ Ir,A = lg (I0/It),19.9.3,15,2.吸收定律,A=kbc,A 吸光度(absorbance) b 介质厚度(length/cm) c 浓度(concentration)
5、 K 吸光系数(absorptivity),当一束平行单色光垂直通过均匀,非散射的吸光物质时, 其吸光度A与吸收物质的浓度c及吸收层厚度b成正比。,19.9.3,16,A,T,C之间的关系,A = lg (I0/It) A = lg(1/T),19.9.3,17,吸光度(A)、透光率(T)与浓度(c)的关系,19.9.3,18,二、摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度,1.摩尔吸光系数:: Lmol-1cm-1,当c的单位用molL-1表示时,用表示.(b : cm )摩尔吸光系数(Molar absorptivity)A bc,物理意义:在一定温度下,当吸光物质的浓度为1 molL时,液层厚度为1cm
6、时,溶液的吸光度。反映了吸光物质进行光度测定的灵敏度,19.9.3,19,摩尔吸光系数()的讨论,吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数,可作为定性鉴定的参数; 与吸收物质本身的性质有关;同一吸收物质在不同波长下的值是不同的。在最大吸收波长max处的摩尔吸光系数,常以max表示。max表明了该吸收物质最大限度的吸光能力,也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。,max越大表明该物质的吸光能力越强,用光度法测定该物质的灵敏度越高。,19.9.3,20,朗伯-比尔定律的适用条件单色光: 应选用max处或肩峰处测定吸光质点形式不变:离解、络合、缔合会破坏线性关系, 应控制条件(酸度、浓度、介
7、质等)稀溶液: 浓度增大,分子之间作用增强,19.9.3,21,2.桑德尔灵敏度:Sgm2,当光度仪器的检测极限为0.001时,单位截面积光柱内所能检出的吸光物质的最低质量,用S表示。S越小,越灵敏经推导: S=M/ gm2一般:S在0.010.001 gm2,19.9.3,22,分光光度计的类型,7.2 分光光度计,19.9.3,23,19.9.3,24,1. 光源(Light source):发出所需波长范围内的连续光谱,有足够的光强度,稳定。可见光区:钨灯,碘钨灯(320 2500 nm)紫外区:氢灯,氘灯(180 375 nm) 2. 单色器(monochromator):将光源发出的
8、连续光谱分解为单色光的装置。 棱镜:玻璃350 3200 nm, 石英185 4000 nm 光栅:波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使用方便,19.9.3,25,单色器,棱镜:依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,19.9.3,26,光栅:,在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。,原理: 利用光通过光栅时 发生衍射和干涉现象而分光.,19.9.3,27,光栅,19.9.3,28,3.吸收池(cell):用于盛待测及参比溶液。,玻璃 能吸收UV光,仅适用于可见光区 石英 不吸收紫外光,适用于紫外和可见光区,4. 检测器(detector):利
9、用光电效应,将光能转成电流讯号。 光电池,光电管,光电倍增管5. 显示装置(display),19.9.3,29,722型分光光度计结构方框图,光源,吸收池,检测系统,分光系统,显示系统,19.9.3,30,19.9.3,31,7.3 显色反应及影响因素,一、 显色反应的选择 1 灵敏度高(High sensitivity),一般104 2 有色化合物组成恒定,符合一定的化学式。性质稳定显色条件易于控制,重现性好。 3 显色剂在测定波长处无明显吸收。对比度好, max60 nm .二、显色剂(Color reagents) 无机显色剂: Fe(SCN)2+,TiOH2O22+ 有机显色剂:,7
10、.3.1 显色反应和显色剂(Color reactions),19.9.3,32,有机显色剂:,生色团(生色团) 能吸收紫外-可见光的基团有机化合物:具有不饱和键和未成对电子的基团产生n *跃迁和 *跃迁, 跃迁E较低,注:当出现几个生色团共轭,则几个生色团所产生的吸收带将消失,代之出现新的共轭吸收带,其波长将比单个生色团的吸收波长长,强度也增强,19.9.3,33,助色团,本身无紫外吸收,但可以使生色团吸收峰加强同时 使吸收峰长移(红移)的基团有机物:连有杂原子的饱和基团例:OH,OR,NH,NR2,X,19.9.3,34,红移,由于化合物结构变化(共轭、引入助色团取代基 )或采用不同溶剂后
11、,吸收峰位置向长波方向的 移动,叫红移(Bathochromic shift).,19.9.3,35,有机显色剂,19.9.3,36,7.3.2 显色条件的选择,1、显色剂用量,Mo(SCN)32+ 浅红 Mo(SCN)5 橙红 Mo(SCN)6- 浅红,Fe(SCN)n3-n,19.9.3,37,二、溶液的酸度,pH1pHpH2,pH,19.9.3,38,酸度的影响,pH3.55.7为适宜的酸度范围,19.9.3,39,三、显色时间和显色温度,T1(),T2(),t(min),19.9.3,40,四,溶剂,降低有色化合物的解离度;提高反应速率;有色化合物的溶解度等。,19.9.3,41,7.
12、4 吸光光度分析及误差控制,7.4.1 测定波长的选择、标准曲线制作,吸收最大,干扰最小,吸收最大,干扰最小,19.9.3,42,标准曲线制作,在一定条件下,测量一系列不同浓度的标准溶液的吸光度,作A-C曲线,19.9.3,43,7.4.2 引起偏离朗伯 比耳定律的因素,主要因素表现为 以下两个方面,1. 物理(光学)因素 2. 化学因素,19.9.3,44,一、物理因素,1.非单色光的影响Beer定律应用的重要前提入射光为单色光,19.9.3,45,2.入射光不平行,不垂直 3.介质不均匀,有反射,散射现象,吸光度偏高 散射和反射使T,A,吸收光谱变形 注:一般可用空白对比校正消除,19.9
13、.3,46,二、化学因素,浓度过高,吸光质点之间作用 改变 化学反应,浓度发生变化 以C代替平衡浓度 解离 络合 使C与平衡浓度的正比关系破坏 缔合,19.9.3,47,三、干扰及消除,19.9.3,48,如测Fe3,磺基水杨酸,. 控制酸度,2.消除干扰方法,19.9.3,49,.掩蔽法,或,Co2, Fe3+,Co2+ FeF63-,Co(SCN)2,NaF,SCN,Co2+、Fe2+、Sn4+,SnCl2,Co(SCN)2,SCN,测Co2(含Fe3+),络合掩蔽法,氧化还原掩蔽法,19.9.3,50,. 增加显色剂用量.选择适当的测量条件,适当波长,参比溶液.分离干扰离子,19.9.3
14、,51,试液 显色剂(试剂) 参比液无 无 蒸馏水(或试+显)有色(共存离子) 无 试液+试剂无 有 显色+试,选择适当参比液 什么是参比液:用来调节仪器A为零的溶液,作为相对标准,抵消其他试剂对光的吸收。,19.9.3,52,7.4.3 仪器测量误差,光度计的读数误差:对于一定的仪器,其读数误差T 是一定的,一般0.002-0.01,相对误差为0.22(T/T),由于T与浓度c不是线性关系,故不同浓度时的T引起的误差不同。,19.9.3,53,19.9.3,54,仪器测量误差,19.9.3,55,浓度测量的相对误差与T(或A)的关系,19.9.3,56,7.5 吸光光度分析法的应用 7.5.
15、1 方法介绍 一.目视比色法,士壤中磷的测定,H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3 =(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O,磷钼黄(小),磷钼(V)蓝(大),19.9.3,57,方便、灵敏,准确度差。,目视比色法,19.9.3,58,二. 示差吸光光度法,当待测组分含量较高时,将产生较大的误差。需采用示 差法。即提高入射光强度,并采用浓度稍低于待测溶液 浓度的标准溶液作参比溶液。设:待测溶液浓度为cx,标准溶液浓度为cs(cs cx)。 则: Ax= b cx, As = b cs =x s =b(cx cs )=bc测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标
16、准溶液 的吸光度之差。由标准曲线上查得相应的c值, 则待测溶液浓度cx : cx = cs + c,19.9.3,59,示差法标尺扩展原理:,普通法: cs的T=10%;cx的T=5%示差法: cs 做参比,调T=100%则: cx的T=50% ;标尺扩展10倍,19.9.3,60,三. 双波长吸光光度法,1.原理:两束波长不同的单色光,以一定的频率交替照到装有试液的吸收池,测出不同波长入1,入2处的吸光度差 (以测量波长相近的波长的A作参比)不需空白溶液作参比;来消除干扰。2.作用:在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。
17、,A A2 A1 (2 1)b c,19.9.3,61,A A2 A1 (2 1)b c两波长处测得的吸光度差值A与待测组分浓度c成正比。1和2分别表示待测组分在1和2处的摩尔吸光系数。 测量波长2和参比波长1的选择与组合,19.9.3,62,基本要求:,在选定的两个波长1和2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。,选定的波长1和2处干扰组分应具有相同吸光度(等吸收点),即:Ay = A y2 A y1 = 0 故:Ax+y = A x=(x2x1)bcx 此时:测得的吸光度差A只与待测组分x的浓度呈线性关系,而与干扰组分y无关。若x为干扰组分,则也可用同样的方法测定y组分。,19.9.3,6
18、3,混浊试液中组分的测定,A 1 -A 2 = A Ac,例 牛奶中微量Fe的测定,选择 入Max测量;选择与入max相差40-m0nm的波长为参比波长,19.9.3,64,双组分共存时的分别测定,在2, A2 = Ax2+Ay2 在1, A1= Ax1+Ay1,A= A2 - A1 = Ax2+Ay2 (Ax1+Ay1)= Ax2 Ax1= Ax,Ay2 Ay1,Ax =(x2 x1)bcx 消除了y的干扰,19.9.3,65,四. 导数光度分析法(自学),导数光谱:吸光度随波长变化率对波长的曲线 吸光度的导数值与浓度成正比,19.9.3,66,7.5.2 方法应用,一.单组分分析: 痕量金
19、属分析 二. 临床分析 三.食品分析 四. 其他应用 一、 弱酸和弱碱离解常数的测定 二、络合物组成的测定,19.9.3,67,一. 弱酸和弱碱离解常数的测定,HA HA,KaH+A/HA,高酸度下,几乎全部以HA存在,可测得AHA=HAc(HA); 低酸度下,几乎全部以A存在,可测得 AA Ac(HA). 代入整理:,配制一系列c相同,pH不同的溶液,测A(设b=1cm).,19.9.3,68,MO吸收曲线,由每份溶液的一对pH、A,可求得一个Ka, 取平均值即可.,19.9.3,69,二.络合物组成的测定 (无机已学),1.摩尔比法: 固定cM ,改变cR,19.9.3,70,2.等摩尔连续变化法:,19.9.3,71,条件形成常数的测定 (设M、R均无吸收),cM + cR= c,MmRn型 ?,19.9.3,72,作业:p337-339. 2,3,4,p337.思考题:3,8,