1、作者单位： 100060.北京. 国家药典委员会 （洪小栩） ； 650118 昆明， 中国医学科学院医学生物学研究所 （李 琦涵） 通信作者：洪小栩， Email： 加强疫苗生产用 Ve ro 细胞的控制 洪小栩 李琦涵 摘要：目前，传统病毒性疫苗生产用细胞基质主要包括原代细胞系、二倍体细胞系和传代 细胞系。近年来， Ve r o 细胞作为连续细胞系在我国越来越多地用于人用疫苗的生产。由于 Ve r o 细胞具有污染内源性或外源性感染因子以及细胞残留蛋白和 DNA 具有潜在致瘤性和 致癌性的风险，因此， Vero 细胞系作为疫苗生产用细胞基质的安全问题备受关注，加强 生产用 Ve r o
2、细胞库的管理和控制；优化疫苗生产工艺，提高对细胞残余蛋白和 DNA 的去 除能力；执行严格的残留量限定标准，对保证 Ve r o 细胞生产疫苗的安全性具有重要意义。 关键词： Vero 细胞、病毒性疫苗、致瘤性、致癌性 Strengthening the Control on the Vero Cell Used for the Production of Viral Vaccines Hong Xiaoxu Li Qihan Abstract: At present, the major cell substrates used for the traditional production
3、of viral vaccines including the primary cell lines, diploid cell lines and continuous cell lines. The safety of the Vero cell strain is the main concerned on the potential risks of the endogenous and exogenous virus contamination, as well as the tumorigenicity and oncogenicity properties induced by
4、the residual cellular protein and DNA. As this result, it will play very important role on improving the safety of viral vaccines by strengthening the management and control of the Vero cell bank, improving the production process, enhancing the ability of the removing the residual cellular protein a
5、nd DNA, and carrying out the strict limit standard. Key words: Vero cell, viral vaccine，tumorgenicity, oncogenicity 一、 背景 日本千叶大学的 Y. Ya s u m u r a 和 Y . Kawakita 两位学者于 1963年研制出 Ve r o 细胞系， 来源于非洲绿猴肾(Cercopithecus aethiops)上皮细胞。 1964年， Simizu 博士将第 93代的 Ve r o 细胞提供给英国的 Tripical 病毒实验室（NIAID, NIH） 。 197
6、9年， 第 113代 Ve r o 细胞提供给美国标准菌种保藏中心 （America Type Culture Collection, A TCC） ，传代至第 121代建立细胞库。Ve r o 细胞为连续细胞系， 可 在体外连续传代，并对多种病毒敏感，包括 SV-40, SV-5、麻疹病毒，虫媒病毒、 逆转录病毒, 风疹病毒、猴病毒、腺病毒, 脊髓灰质炎病毒, 流感病毒, 副流感 病毒, 呼吸道合胞病毒、牛痘病毒等多品种病毒。因此，Ve r o 细胞制备后被就 广泛应用实验室的相关生物学检测，如病毒扩增和空斑检测等 二、Ve ro 细胞在疫苗生产中的应用 法国梅里厄研究所最早对疫苗生产用Ve
7、 r o细胞的特性进行了深入的研究， 二十世纪八十年代， 该公司采用Ve r o细胞生产的脊髓灰质炎灭活疫苗（IPV） 、 口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（OPV）以及人用狂犬病疫苗相继在法国批准上市。 1990 年，美国批准了IPV的注册申请，批准用于儿童的免疫 1 。自二十世纪九 十年代以来，是Vero细胞用于疫苗研制发展最快的时期，多种病毒性疫苗相继 获得批准。近十来，我国病毒性疫苗的研究也取得了快速发展，新型疫苗不断 涌现， 特别是病毒性灭活疫苗， 需要更大规模的病毒培养以获得更多病毒抗原； 同时，随着先进的细胞培养技术，如生物反应器、 发酵罐细胞悬浮培养技术的 推广应用，也使得更多的生产企
8、业倾向选择Vero细胞进行病毒性疫苗的生产。 表1 国内外采用 Ve r o 细胞生产疫苗的情况 国家 制品 美国 脊髓灰质炎灭活疫苗（IPV） 天花疫苗 口服轮状病毒 2 欧洲 脊髓灰质炎疫苗 人用狂犬病疫苗（Ve r o 细胞） 流感疫苗(Vero 细胞) 天花疫苗 3中国 人用狂犬病疫苗（Ve r o 细胞） 双价肾综合征出血热灭活疫苗（Ve r o 细胞） 冻干乙型脑炎灭活疫苗（Ve r o细胞） 4甲型肝炎灭活疫苗（Ve r o 细胞） 肠道病毒71 型灭活疫苗（Vero细胞） *脊髓灰质炎灭活疫苗 * 注： *为在进行进行临床考核的制品 三、 Ve ro 细胞的特性 目前，传统病毒
9、性疫苗生产用细胞基质主要包括原代细胞系（Primary cell lines, PCLs） 、 二倍体细胞系(Dipoild cell lines, DCLs)和传代细胞系（Continuous cell lines, DCLs） 。虽然PCLs和DCLs作为细胞基质风险性较低，但也存在诸多的 缺点，比如，PCLs在制备过程中存在容易污染内源性或外源性感染因子的污染； 产量低，成本高；制品细胞批间差异大等问题；同时存在伦理方面的异议。对于 DCLs而言，由于有限度传代，因此存在生产量小，对培养基的条件要求较高、 不易大规模生产等问题。而Ve r o细胞由于其细胞特性，具有无限的寿命，具有生 长
10、快速，容易培养，对培养基的条件不高、可用于现代的培养方式，如生物反应 器的培养，适用于大规模的病毒培养，对于需要较高抗原量的病毒性灭活疫苗的 生产，解决了生产规模瓶颈的问题。与此同时， Ve r o细胞用于人用疫苗的生产也 存在诸多问题， 一是细胞系中存在潜在感染性因子的风险，这些潜在的感染性 因子可能是目前对于连续细胞系质量控制规定的检测方法所不能够检测出的； 二 是参与宿主蛋白和宿主DNA 可能导致致瘤性和致癌性的风险 5 。加强生产用 Ve r o细胞安全性控制引起全球广泛关注。当前，我国越来越多的疫苗产品采用 Ve r o细胞进行生产，加强生产用Ve r o细胞的控制，是保障产品安全性
11、的前提。疫 苗生产企业无论是对已上市的产品还是在研制品， 应重点考虑一下几方面问题。 1. 加强 Ve ro 细胞库的管理和检定 多年来，尽管PCLs和DCLs已成功用于疫苗生产，并在安全方面得到有效的 证明，认为这类细胞DNA残留无任何风险，但CCLs由于调控生长基因失调而具 有无限的寿命。因此认为，来源于CCLs的 DNA 有可能致使其他细胞生长失控或产生致瘤性 6 。 早期研究证明Ve r o细胞具有致瘤性，采用无胸腺小鼠和Syrian 豚鼠进行试 验， 豚鼠检测结果为阴性， 小鼠接种部位出现结节。 其他肿瘤细胞如Hela、 Hep-2 细胞接种动物，没有发现治转移瘤。接种免疫缺陷新生小
12、鼠，90%以上出现肿瘤 生长；3 周后 40% 动物肺部出现转移瘤。但将Ve r o细胞传至第 169 代接种动物 为发现致瘤性 7 。WHO 指南中指出，采用新生小鼠研究表明，细胞代次在 P134-P150 代之间接种动物不会产致致瘤性 8 。由此，应尽可能使用早代的Ve r o 细胞用于疫苗生产， 降低Ve r o细胞致瘤性/致癌性的风险。通常规定在 137代建 立主或工作细胞库， 在 142代用于疫苗生产。 9WHO 生产用 Ve r o 细胞库的主细胞库为第 134代，并规定疫苗生产用最高传 代次数不高于第 150 代。我国疫苗生产用 Ve r o 细胞一般来源于中国食品药品检 定研究
13、院或 AT C C，生产企业从中检院获得的细胞代次一般在第 126-127 代，生 产疫苗的细胞代次在 148 代以内； 从 AT C C 获得的细胞代次一般在 127 代，疫 苗生产用细胞的高限定代次不超过 150代。 另外，Ve r o 细胞株应有非常明确的来源和传代背景。 研究表明， 对于不 同核型的 Ve r o 细胞株其致瘤和致癌性存在较大差异10。 因此， 应选用经过 全面检定、目前已经普遍被 WHO 认可并已经获得批准的用于疫苗生产。 同时 应规范细胞传代的方式， 并按照相关要求对细胞库进行全面的检定。 同时， 国 际上对生产用 Ve r o 西坝的控制也在不断提出新的要求, 正
14、在讨论的 WHO 关于 人用疫苗生产细胞基质规程中对 CCLs 细胞拟增订致癌性检测。 2. 加强 Ve ro 细胞污染感染因子的控制 通过免疫缺陷动物模型试验表明，Ve r o细胞可能含有并表达内源性病毒。 同时， 细胞DNA有可能插入外源性逆转录病毒的前病毒基因序列。 因此， 加 强对生产用Ve r o细胞外源因子的控制对于保证制品安全性至关重要 11 。 在细胞 库建库过程中以及生产终末细胞，均要求对内源性和外源性病毒进行检定。检测 方法除了采用常规的动物体内实验和体外培养法外，还应不断采用更为先进、成 熟的检测技术， 包括采用增强电镜法、PCR扩增技术、基因测序分析以及RNA 转录等，
15、提高检测方法灵敏度，确保使用的Ve r o细胞无内源性或外源性病毒污染 12 。 3. 执行严格的 Ve ro 细胞 DNA残留限定标准 目前， 国际上对于细胞DNA可导致的致瘤性仍是热议的焦点。根据动物致 癌基因模型的风险性评估显示，体内暴露 1ng的细胞DNA（基因组中含有某一具 有活性的致癌的 100 拷贝）可引起 1/10 9 个受体发生转化。因此，研究认为，当 细胞残留DNA不高于 100Pg/剂量时，CCLs细胞DNA潜在的风险可忽略不计。在 制定残留DNA 的限定标准时，主要考虑的不是DNA本身，而是减少编码具有活 性致癌基因的DNA序列。另外研究也发现，细胞DNA 嵌入突变可导
16、致瘤变的的 危险性很低，通过嵌入性突变方式，10ug DNA 可导致疫苗接种者的一个细胞的 1/10 7 个受体的 2个独立肿瘤抑制基因失活。不过，近年来也有发表的相关数据表 明， mg 级的来源于人类肿瘤细胞具有致癌基因的DNA，对灵长类动物进行的长 达 10年的评价观察未造成肿瘤的发生。另外，生物制品中含有的DNA 通常是以 片段形式存在，不太可能编码功能性基因。根据目前的认识来看，传代细胞的 DNA可视为是细胞的污染，而不是作为一种重要的风险因素需要去除到极低的 水平 12 。 自中国生物制品规程 （2000年版）对Ve r o细胞生产的病毒性疫苗产品增 订了细胞DNA残留量测定，限定标
17、准为不高于 10ng/剂 13 ；根据WHO 相关指南 以及欧洲药典的相关规定，2005 年版中国药典三部又将Ve r o细胞DNA残留 量限定标准提高到应不高于 100pg/剂， 通过执行严格的限定标准， 以提高产品 的安全性 4 。 表 2 国内外对疫苗 Ve r o 细胞 DNA 残留量控制要求 制品 WHO指南 14 欧洲药典 3 中国药典 4 人用狂犬病疫苗 10ng/剂 10ng/剂 100pg/剂 双价肾综合征出血热灭活 疫苗 / / 100pg/剂 天花疫苗 / 10ng/剂 / 流感疫苗 / 10ng/剂 / 冻干乙型脑炎灭活疫苗 / / 100pg/剂 甲型肝炎灭活疫苗 *
18、 / / 10pg/剂 肠道病毒 71 型灭活疫苗 * / / 10pg/剂 脊髓灰质炎灭活疫苗* / 10pg/剂 100pg/剂 注：* 企业注册标准； * 正在进行临床试验 目前， 国内外对Ve r o细胞DNA残留量的检测方法主要包括探针杂交法、荧光染 色法、阈值法以及定量PCR法 15 。 表3 Vero 细胞 DNA 残留量测定检测方法对比 探针杂交法 荧光染色法 ELISA (阈值法) 定量PCR法 16 特异性 种特异性 / / 序列特异性 检测最小序列长度（bp） 50 50 600 50-200 灵敏度（pg） 1-5 1000 1-5 1 目前国内普遍采用 DNA 探针杂
19、交法为半定量检测方法，操作方法的规范 化、探针的制备以及实验室间检测存在的差异对结果的判定影响很大。 国外目 前已经采用 Q-PCR 法检测， 无论从检测的灵敏度、可靠性以及可定量方面均优 于探针杂交法。目前我国也在加快此方法的建立。 4. Vero蛋白残留量的控制 严格控制疫苗中残留的Ve r o细胞结构蛋白也是降低致瘤性风险的重要措施。 2010年版药典三部新增订了采用ELISA （双抗原夹心法） 检测Ve r o细胞残留蛋白， 限定标准为应不高于半成品配制总蛋白量的 10%。 通过对Ve r o细胞的宿主蛋白 和DNA残留量的控制， 提高产品的安全性。 17 5. 加强生产工艺控制 对于
20、确保产品的安全性除可加强对Ve r o细胞可能存在潜在风险的DNA和蛋白 残留量进行严格的控制外，应不断优化生产工艺，最大程度地去除宿主DNA 和 蛋白；加强对产品工艺的控制，对生产工艺的各个环节验证对Ve r o细胞蛋白和 DNA的去除效果，保证残留量在可接受的范围内。另外，应进一步验证生产工 艺处理过程以及所使用的化学试剂对DNA片段活性的影响， 研究表明，-丙内 酯作为病毒灭活剂，可破坏DNA 的 活性。采用这种病毒灭活剂对于DNA 在规定的限度内的制品安全更有保证 18 。 WHO建议在生产工艺中可加入DNA酶， 剪切Ve r o细胞的DNA片段，降低编码具有活性蛋白的潜在风险，但不惜
21、对加入 DNA酶的安全风险进行全面评估， 并对DNA酶的残留量做出严格的控制。 结束语 Ve r o 细胞用于人用疫苗的生产已有近 30年的历史， 尽管大量临床使用证明， Ve r o 细胞制备的疫苗是安全， 但 Ve r o 细胞具有致瘤性和致癌性的风险应引起我 们特别的关注。规范疫苗生产用 Ve r o 细胞株的选择， 严格 Ve r o 细胞建库的管 理和检定；完善生产工艺，加强生产工艺过程的质量控制、最大程度地去除细胞 DNA 和蛋白残留量，执行国家药典规定的限定标准; 同时还应不断地将先进成 熟的生物技术运用到细胞的质量控制中，进一步加强对 Ve r o 细胞可能存在的内 源性和外源
22、性感染因子的控制、完善细胞 DNA和蛋白残留量的测定方法，理由 现有的技术手段将 Ve r o 细胞的潜在风险降至最低，以保障疫苗制品的安全。 参考文献： 1. History and Characterization of the Vero Cell Line, A report prepared by CDR Rebecca Sheet, Ph.D., USPHS CBER/OVRR/DVRPA/VVB （www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/00/backgrd/3616b1a.pdf） 2. Vaccines Licensed for Immunization an
23、d Distribution in the US with Supporting Documents,Vaccines, Blood 6. Guidance for Industry Characterization and qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccine for Infectious Disease indications , U.S. Department of Health and Human Services F
24、DA, CBER, Febrary 2010, （http:/www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guid ances/default.htm. ) 7. B. Montagnon, B Fanget, Purified Vero Cell Vaccine for Human, Laboratary techinques in Rabies, 4th edition, 1996, Charcter 25； (http:/www.who.int/rabies/vaccines/en/
25、Laboratory_techniques_in_rabies_chapter26.pdf) 8. Acceptability of cell substrates for production of biologicals, WHO TRS No. 747, 1987 9. Requirements for the use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals, World Health Organization TRS No. 878, 1998. 10. Zhang Deli, J
26、i Liang, etc. Systematically experimental investigation on carcinogenesis or tumorigenicity of VERO cell lines of different karyotypes in nude mice in vivo used for viral vaccine manufacture，Acta Genetica Sinica July 2004 (31）7: 647-660 11. Recommendations for the evaluation of animal cell cultures
27、as substrates for the manufacture of biological medicinal products and for the characterization of cell banks ， WHO, 2010 (http:/www.who.int/biologicals/Cell_Substrates_clean_version_18_April.pdf) 12. Guildelines on Assessing Risk When a Potential Adventitous Agent is Found, WHO, April 11, 2011. 13.
28、 中国生物制品规程， 2000 年版， 中国生物制品标准化委员会， 北京， 化学工业出版 社， 2006.6 14. Requirememts for rabies vaccine (inactivated) for human use produced in continuous cell lines, WHO TRS No. 760, 1987. 15. U.S.Pharmacopoeia National Formulary 25, Vol. 1, 2007. 16. James S. Robertson , Alan B. Health, A Collaborative Study t
29、o Examine the Sensitivity and Reproduubility of Assays for the Detection of DNA in Biologicals Derived from Continuous Cell Lines,Biologicals (1992) 20, 73-81. 17.王辉、 张月兰等，疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法的建立， 中国生物制品 学杂志 2007（12）：937-939； 18.Perrin, P., Morgeaux, S. (1995) Inactivation of DNA by beta-propiolactone. Biologicals 23, 207-211.
