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3、tion of cD44 vadant 6 expression and clinicopath。lo百cal factors i“pulmonary metastases fmmcolon carcinomaJOncol Rep，2003，ll(1)：1875187720Lju Y J，Yan P s，u J，et a1E1pression and si印mcance of cD“s，cD44v6，and nm23 mRNA in human c孤cerJworld J castmentemlogy，2005，ll(42)：6601660621Ranuncolo s M，I丑deda V，s
4、peetemlan s，et a1cD44 expression in hu一lan diomJs“rg 0ncol，2002，79(1)：30一3522Oz B，K姗yel F A，Gazio N L，et a1The distribution of extraeelluIarmatrix pro teins aIl d c【s elpression in hum蛐astrocytomasJPathol OncoI Res，2000，6(2)：118一12423 Buccoliero A M，caldareua A，A。gaIlini L，et a1Oligodendm毋ioma：cD44
5、as a po商b18 prognostic opPonunityJclin Neuropathol，2003，22(4)：16917524Stella M R，Virginia L，susaIla G，et a1Expression of cD44s and cD44splice variantsin hummelanomaJ0ncol Rep，2002，9(1)：5156钙调神经磷酸酶抑制剂的研究进展于 倩，葛志强(天津大学化工学院制药工程系，天津300072)摘要：钙调神经磷酸酶是迄今发现的唯一受ca+或钙调素调节的丝氨酸苏氨酸蛋白质磷酸酶，参与多种细胞功能的调节。该酶的抑制剂在移植免疫
6、等方面的研究方兴未艾。此文综述了国外对该酶抑制剂的研究进展。关键词：钙调神经磷酸酶；抑制剂；综述中图分类号：R9795 文献标识码：A 文章编号：1005一1678(2007103021003Re船arch p咄sS on the jIlllibitors of calci鹏urinYU Qian，GE zhiqiang(鲫。尼砒n旷鼢口，7勰cemicoZ E喈i珊e订ng，5coDZ矿现e戚c谢Engi眦e昭。凡d死如nDZo，死。耐凡眈rsiy，no埘n 300072，劬ino)钙调神经磷酸酶(calcineurin，caN)是迄今发现的唯一受ca2+或钙调素(caJmodulin，ca
7、M)调节的丝氨酸苏氨酸蛋白质磷酸酶。caN在全身组织广泛分布，在神经组织及T淋巴细胞中含量特别丰富，在心脏及骨骼肌中也有较高表达，是能够参与多种细胞功能调节的多功能信号酶。近年来，有关caN生理作用的认识有了长足的进展。当初只知道其为磷酸二酯酶抑制剂，而现今已发现其在免疫系统、神经系统、心血管系统等方面均具有重要作用。由于caN的脱磷酸化作用在多种细胞增殖与分化过程中均扮演着重要角色，特别是在细胞因子介导的T细胞活化中起着调节枢纽作用，因此收稿日期：20060630；修回日期：20060814作者简介：于倩(1982一)，女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，研究方向为生物制药工程；葛志强(1963
8、)，男，天津人，通信作者，副教授，主要研究方向为生物制药，Tel：022-27403888，Emaii：gezlljq。youCOmo该酶的抑制剂在移植免疫方面的研究方兴未艾。目前临床上应用最多的是子囊霉素衍生物环孢素A(yclospodneA，csA)、他克莫司(tacroIimus，FK506)和匹美莫司(pimecmlimus)。它们具有相似的理化性质、作用机理和作用效果。但它们的毒副作用成为应用该类抑制剂的重要障碍。鉴于此，众多研究人员试图开发出作用明确，专一性强，毒副作用小的caN抑制剂，本文拟就该领域近年的研究进展作一简要综述。1 CaN的结构caN是由1个相对分子质量(M，)为5
9、9 000的催化亚基calcineurin A(CnA)和1个M，19 Ooo的调节亚基calcineurin B(cnB)组成的二聚体(23。催化亚基CnA由521个氨基酸组成，与其他蛋白质磷酸酶具有高度的同源性。cnA可分为4个不同的结构域：(1)催化区域位于1346氨基酸残基处；(2)与cnB结合的螺旋状区域(BBH)位于347373氨基酸残基万方数据中国生化药物杂志chinese Joumal of Biochemical Ph蛐Ilaceutics 2007年第28卷第3期 211处；(3)钙调素结合区域位于390414氨基酸残基处；(4)自身抑制区(autoinhibitory 1
10、00p，AL)位于469486氨基酸残基处。BBH是1个两性分子螺旋，其一面与CnB相结合，另一面又可以与免疫亲和蛋白质一抑制剂复合物相结合。BBH只含疏水残基的一端和cnB的部分残基组成了疏水核心，而其同时含有疏水残基和亲水残基的另一端则与cnB的部分残基组成了可以结合免疫亲和蛋白质一抑制剂的复合物表面。cnB与caM一样具有2个“EFhand”，即4个ca2+结合位点，与BBH区域平行排列。cnB不具有磷酸酶活性，但对于维持caN的高度专一是必须的，其功能与caM对酶活力的调节不可相互替代【2 J。2外源性抑制剂及其作用机理外源性抑制剂顾名思义是指来源于体外、机体自身不能产生的一类抑制剂。
11、目前，临床上常用的caN抑制剂是子囊霉素的衍生物，包括csA、FK506和匹美莫司。csA是一个由11个氨基酸组成的环状多肽。Fl506是一种大环内酯类抗生素，其效力是csA的lo100倍。匹美莫司专门用于治疗皮肤炎症H J。这3个外源性抑制剂的作用机理非常相近，都是先与细胞内各自相应的免疫亲和蛋白质结合，使得BBH向免疫亲和蛋白质一方有所偏移，从而提高了免疫亲和蛋白质一抑制剂复合物结合caN的能力，以抑制caN的酶活力。免疫亲和蛋白质与CaN的结合在整体上并没有改变caN的蛋白质构象。csA、Fl(506和匹美莫司各自的免疫亲和蛋白质分别是亲环素(cycIophilins，cyPA)、Fl(
12、506结合蛋白(FKBPs)L5 J和巨菲蛋白一12(macmphilin一12)【6|。例如，FK506一FKBPl2复合物结合到caN的BBHcnB表面距caN的活性部位很近，由此产生的空间位阻使得caN的蛋白质底物无法接近caN的磷酸酶活性区域，从而阻止了caN对底物的脱磷酸化作用L2 J。然而，caN在与小分子底物对硝基苯酚磷酸酯(pamnitmphenylphosphale，pNPP)反应时，其磷酸酶活性增长了23倍，说明免疫亲和蛋白质一抑制剂复合物对caN活性的调节机制决不仅仅是空间位阻这么简单。caNcvPAcsA的结构表明caN上的催化残基Argl22和cyPA上的Ar9148
13、之间只有一个氢键的距离，因此cyPA很有可能限制着Argl22的构象，说明cyPAcsA可以直接调节caN的活性。此外，“caN一免疫亲和蛋白质一抑制剂”复合物结构展示出了caN的自身抑制区可以与cvPA和FKBPl2进行反应，表明免疫亲和蛋白质一抑制剂复合物可能影响caN自身抑制区的构象。为了克服csA和Fl(506等抑制剂毒副作用大、专一性差等问题，国外近年来又开发了一种新的caN抑制剂ISA247。ISA247是由Isotechnjka公司研制开发的CsA的类似物，其分子组成主要是csA分子中的l、4、9位氨基酸的氢原子被氘原子取代(美国专利6613739和6605593)。IsA247
14、是由顺、反两种异构体组成的混合物，而其中只有顺式异构体才具有caN的抑制活性。目前已证实IsA247比csA具有更强的caN抑制功效，但有关其高效的抑制机理目前还未见文献报道【7。2006年1月4日，美国FDA已批准IsA247进入移植排异治疗的期临床。同时，牛皮癣的治疗已经进入期临床阶段。3 内源性蛋白质抑制剂及其作用机理一般认为内源性蛋白质抑制剂是指存在于体内、不受外界影响即可自发调控caN的一类蛋白质，其与外源性抑制剂作用机理最大的不同之处在于不需要免疫亲和蛋白质作为中问的桥梁，可直接作用于caN。根据内源抑制蛋白质对caN的作用机理不同，可以把这些内源抑制蛋白质分为3种类型【8 J：(
15、1)caN的直接抑制蛋白质，这些蛋白质可与caN直接结合抑制caN的活性，其中包括cain、FKBP38、cHP等；(2)caN的双向调节蛋白质，这些蛋白质对caN的活力既有促进作用又有抑制作用，其中包括MclP等；(3)caN的锚定蛋白质，这些蛋白质的主要作用是切断caN与其他信号虽白质或亚细胞结构之间的联系，其中包括AKAP79等。31 CaN抑制剂(calcineuIin khibjt叫，Cain)Cain是caN的多功能抑制剂，是1个M，为240 0()O的蛋白质，其c末端有一段由38个氨基酸组成的caN结合区域，这一小部分氨基酸序列称为P)【kIT(x代表任意氨基酸)旧J。P)【Ix
16、IT已在作为caN底物的活化T细胞核因子(Nuclear Factorof Activated T ceus，NFAT)蛋白质家族的不同成员中发现，该序列的去磷酸化是NFAT蛋白质和caN之间进行反应的关键。已经有人应用竞争抑制实验研究证实，由于c“n结构中存在PxIxIT序列，使其可以竞争性的与caN结合，从而抑制caN与NFAT蛋白质的结合，阻断T细胞受体信号转导通路【8j。另外，sun Ll oJ等在哺乳动物双杂交系统中发现，cain和caN之间的反应依赖于ca2+和PKc的信号传导作用。cain只与由Ca2+活化了的caN反应。PKc可通过激活其他激酶而导致cain的过磷酸化，从而提高
17、cain与caN的亲和性，导致caN无法与其它底物结合，阻断其正常发挥脱磷酸化的能力。32 F飚06结合蛋白质38(f1凶06-bindiDg_p哦ein8 38，nP38)FKBP38存在于线粒体膜上。FKBP38包含4个区域H“：一是Fl506结合区域，这是FKBP家族成员特有的区域，一般情况下，本区域的主要功能是结合FK506以及保持其肽脯氨顺反异构酶活性(PPIase)，但FKBP38并没有PPIase活性和结合FI(506的能力，它的活性是由ca2+或caM调节的；二是3个四联肽重复区(tetracopeptide”peats，TPR)；三是caM结合区；四是跨膜(TM)区域。shi
18、mne等l”12003年报道称FKBP38是caN的内源抑制剂，它可以在不需要外源性配基的情况下，单独作用于caNNFAT通路。但是，最近的研究有不同的观点，weiwad等应用核磁共振(NMR)对FKBP38蛋白质的结构进行了解析，并通过生物学实验证实FKBP38不能在缺乏外源性Fl(506的情况下单独抑制caN的活性，因此，FKBP38是否为caN的内源蛋白质抑制剂还存在争议【13。1“。33 CaN同源蛋白质(Calcinellrin H伽l090惜in，cHP)cHP是cnB的同源蛋白质，目前已发现cHP-1和cHP一2两个异构体。cHP-l由195个氨基酸组成，包含4个ca2+结合位点
19、。序列分析表明其与cnB和caM分别有65和59万方数据212 中国生化药物杂志chinese Joumal of Biochemical Phanaceutics 2007年第28卷第3期的同源性，在人类各种组织中广泛分布。动物体内实验显示，CHPl对caN磷酸酶活性的抑制不是通过与caM竞争结合cnA上的调节位点，而是通过改变cnAcnBcaM三聚体的组装，抑制了caN的活性。此外发现，cHP-1表达、caN活性与T细胞的活化之间存在着反馈调节机制，cHP-l过度表达会通过抑制caN活性而阻断T细胞的活化；T细胞活化又可以反馈性抑制CHP-1的表达5。34 caN调节蛋白质(M0d山ory
20、 calcinein Imerac衄Protein，MC口)McIP是从酵母到人基因序列高度保守的caN内源蛋白质抑制剂。这个家族蛋白质对caN具有双向调节作用，即当caN处于高浓度时抑制caN的活性，而当caN处于低浓度时又可以激活CaN，这是此家族蛋白质区别于以上CaN抑制剂的显著特点【8 J。vega等【16的研究指出，McIP上至少有3个不连续的区域参与抑制caN。其中的1个区域即为PxIxIT序列【”J。在体内，McIP的c末端和N末端以及P)(IxIT序列共同作用，竞争结合caN以抑制caN的活性。动物体内实验发现敲除McIP基因后，导致了caN的活性在很大程度上减弱。这个发现使人
21、们认为McIP可能是caN蛋白质正确折叠的必要因素或参与caN的底物识别，也可能同时发挥以上两种作用。也就是说，MICP对CaN不光有抑制作用，更可以适时激活CaN8 1。35 激酶锚定蛋白质(AKin鹅e胁ho五且g Pmtein，AKAP)AKAP可以同时锚定磷酸激酶和磷酸酶，是可与caN进行多位点结合以发挥其抑制功能的内源抑制蛋白质。这个家族中被研究最多的就是AKAFr79，它是具有多种化合价的锚定蛋白质，对磷酸酶A、磷酸酶c和caN均有显著作用。在结构上，AJ姐P79的337343位的氨基酸残基构成的也是PxJxIT序列，与cajn和McJP相似，只要存在这个序列，AKAP79即可识别
22、微量的caN并发挥抑制作用。此外，PxIxlT序列的上游肽段也有助于结合并抑制caN的活性“】。4结语和展望caN是生物体内重要的一种磷酸酶。过度表达的CaN会对机体产生很多不利的影响，例如过度表达的CaN会导致心肌肥大和遗传过敏性皮炎等。此外，该酶在异体移植排异反应的发生中也起着关键作用，所以开发和研究caN的抑制剂是十分必要的。目前应用较为广泛的csA和FI506由于其严重的毒副作用，正有被其他新型抑制剂取代的趋势。IsA247正是这样的特异性高，毒副作用小的替代物。在研究外源性抑制剂的同时，也不应忽视对内源蛋白质抑制剂的研究开发，内源蛋白质抑制剂具有高效专一低毒的特点。也应注意到PxIx
23、IT序列均存在于内源抑制蛋白质cain、McIP和AlFr79结构中，因此可以以该特异性结构为着眼点，利用分子模拟技术，设计和筛选出有效的分子构型，为实验研究提供大量的先导化合物。参考文献：1 Rusnak F，Mertz P calcineun：fo珊and functionJPhysiol Rev，2000，80(4)：148315212 Ke H M，Huai Qstructures of calcineun and its complexes with immunophiIinsimmunosupplssantsJ jBiochem Biophys Res commun，2003，3“
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