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类型第6章 色谱分离过程.ppt

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  • 上传时间:2019-08-28
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    第6章 色谱分离过程.ppt
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    1、1,第6章 色谱分离过程 Chromatography,6.1 概述 6.2 色谱分离过程的基本原理 6.3 色谱的分类 6.4 色谱分离过程基础理论 6.5 典型制备色谱工艺及应用,2,3,定义也称色谱层析、色谱、色层;样品中各组成依据其在固定相与流动相之间作用行为的差别进行多次分离的过程。 发展史1903年一位俄国植物学家首次提出。1931年首次应用于制备;1938年适用范围扩展至无色物质;,6.1 概述,4,1903年俄国植物学家Tswett实验示意图,固定相CaCO3颗粒 流动相石油醚,5,色谱法的特点,优点:“三高”、“一快”、“一广”,缺点:,高选择性可将性质相似的组分分开高效能反

    2、复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果高灵敏度10-1110-13g,适于痕量分析分析速度快几几十分钟完成分离一次 可以测多种样品应用范围广气体,液体、固体物质化学、生化色谱分离、分析,对未知物分析的定性专属性差需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS),6,6.2 色谱分离过程的基本原理,1.分离原理,色谱法之所以可以分离混合物,关键是它有一个高效的色谱柱。物质在柱内的分离过程,是物质在固定相和流动相之间发生吸附、脱附(或溶解、解析)的过程。被分离物按其溶解和解析的能力(或吸附和脱附的能力)的大小,以一定的比例分配在固定相和流动相之间。溶解(吸附)能力大的组分分配给固定相多一些,分配

    3、给流动相少一些。这可用分配系数K表示。,7,分配系数的微小差异吸附能力的微小差异 微小差异积累较大差异吸附能力弱的组分先流出;吸附能力强的组分后流出,8,2.固定相(色谱柱填料),硅胶衍生的固定相 离子交换树脂 大孔吸附树脂 凝胶 手性固定相,纤维素衍生物 环糊精相 聚(甲基)丙烯酰胺 -酸和 -碱固定相,9,3.色谱柱及柱技术,色谱柱装填方法色谱柱设计,高压匀浆填充 干法填充 径向压缩法 轴向压缩法 环形压缩技术,“饼式”柱 面进样 轴向流动,10,6.3 色谱的分类, 根据色谱法中两相的物理状态分:,根据固定相的形状分:,11,按分配原理分:,按分离的动力学过程分:,12,基本类型色谱法的

    4、分离机制,基本概念:固定相(s);流动相(m),(一)吸附色谱法 (二)分配色谱法 (三)离子交换色谱法 (四)空间排阻色谱法,13,(一)吸附色谱法,要求:固定相吸附剂(硅胶或Al2O3)具表面活性吸附中心 分离机制:见图示,吸附平衡 Xm + nYaXa + nYm,14,分离机制:各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离,吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开,15,(二)分配色谱法,要求:固定相机械吸附在惰性载体上的液体流动相必须与固定相不为互溶载体惰性,性质稳定,不与固定相和流动相发生化学反应 分离机制见图示,狭义分配系数,16,图示,分离机制

    5、利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离,连续萃取过程 back,17,(三)离子交换色谱法,要求:固定相离子交换树脂 流动相水为溶剂的缓冲溶液 被分离组分离子型的有机物或无机物 分离机制见图示,阳离子交换树脂 RSO3-H+ + X+ RSO3-X+ + H+,18,图示,分离机制:依据被测组分与离子交换剂交换能力(亲和力)不同而实现分离 back,19,(四)空间排阻色谱法,要求:固定相多孔性凝胶流动相水凝胶过滤色谱流动相有机溶剂凝胶渗透色谱 分离机制见图示,20,图示,分离机制:利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离 back,21,结论:,四种色谱的分离机制各不相同

    6、,分别形成吸附平衡、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡K分别为吸附系数,狭义分配系数,选择性系数和渗透系数。,除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶孔径大小有关外,其他三种K值都受组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响。,22,亲和色谱(Affinity chromatography),载体活化、配基连接、吸附、洗脱,23,色谱图及有关术语 色谱图是以组分的响应信号(或浓度)为纵坐标,时间为横坐标的色谱流出曲线;它提供定性和定量分析的依据及色谱操作条件的有关信息。如下图:,24,(1)基线没有组分进入检测器时,检测器系统的噪声随时间变化的曲线通常为一条直线。当系统不稳定时,

    7、基线会随时间而定向缓慢变化的现象,称为基线的漂移;当系统不稳定时,不同因素引起基线的起伏变化的现象,称为基线的噪声。 (2)保留值是色谱法定性的依据。可以用组分在色谱柱中的滞留时间或使组分流出色谱柱所需要的流动相体积表示。 死时间(tR0)-不与固定相发生作用的组分(空气或甲烷)流过色谱柱所需的时间。死时间正比于色谱柱中的空隙体积。,25,保留时间(tR)-组分流过色谱柱所需要的时间,一般指从进样到柱后组分浓度最大值时所需的时间。 调整保留时间(tR)-扣除死时间后的保留时间 (tR=tR-tM)。 用使组分流出色谱柱所需流动相体积表示时为: a死体积(Vm) VM=tMF0 b保留体积(VR

    8、) VR=tRF0 c调整保留体积(VR) VR=tRF0=VR-VM,26,(3)峰高与峰面积 峰高是色谱峰的顶点到基线之间的垂直距离,用h表示;峰面积是色谱流出曲线与基线所围成的面积,用A表示。 (4)区域宽度 是反映分离好坏的一个重要参数。一般,区域宽度越窄越好。可用三种方法表示: 标准偏差():0.607倍峰高处峰宽的一半。 峰底宽度():色谱峰两侧切线在基线上的截距 =4 半峰宽度( 1/2):又称半宽度或区域宽度,峰高一半处的宽度。,27,28,1.根据色谱峰的数目,可以判断试样中所含有组分的最少个数。2.根据色谱峰的保留值可以进行定性分析。3.根据色谱峰高或面积可以进行定量测定。

    9、4.根据色谱峰间距及其宽度,可对色谱柱的分离效能进行评价。5.色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。,从色谱流出曲线可以获得许多重要信息:,29,6.4 色谱分离过程基础理论,1.保留值、分离度和柱效率,分配系数(K):,K因物质不同而不同;K是温度的函数;是色谱分离的基础。 K大的物质在柱内停留的时间长,反之则反。由于在柱中的多次平衡分配故K有微小差别的组分,在通过柱子后被扩大,从而被分离。,30,分配比(k):又称容量因子。,K与k之比较:,式中,为相比,为柱中流动相体积与固定相体积之比。它反映了柱型的特点:填充柱=635;毛细管柱=50-1500。,31,K和k与物质及两相的性质有

    10、关; K 与k都是温度、压力的函数; K与两相的体积无关;k与两相的体积有关,即与相比有关; K与k是衡量色谱柱对组分保留能力的参数;K与k值越大,保留时间越长;,32,分离度:相邻色谱峰峰顶之间的距离除以此两色谱峰的平均宽度。,33,柱效率:,34,2.色谱理论模型,色谱分离过程涉及到两个方面:其一是色谱分离与物质在两相中的分配系数有关这由物质(包括组分、流动相、固定相)的分子结构和性质决定这也就决定了各组分在柱后的出峰时间,即色谱过程中的热力学因素;其二是色谱分离与物质在柱内的运动情况有关这由物质在流动相和固定相间的传质阻力决定这也就决定了各组分色谱峰的形状和区域宽度,即色谱过程的动力学因

    11、素。,35,色谱理论包括两方面: 热力学理论:研究分配(分离)过程,塔板理论(plate theory)。 动力学理论:研究各种动力学因素对峰展宽的影响,速率理论(rate theory)。,36,塔板理论 (the plate model),1941年,Martin和Synge阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性,将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成;与精馏相似,色谱分离也是一个分配平衡过程。这就是Martin等人提出的塔板理论。,37,塔板理论基本假设,色谱柱由一系列塔板组成塔板内,组分在两相间迅速达到平衡(理想色谱)组分的分配系数不随它的浓度变化而变化(线性分布等温线)组分的轴向

    12、扩散为零流动相的流动是跳跃过程,38,39,H=L/N,塔板理论方程:,若扣除死时间(体积)的影响,得到有效塔板数(n)和有效塔板高度(H):,H=L/N,40,它们比理论塔板数及高度,能更有效地反映色谱分离好坏与塔板数和塔板高度之间的对应关系。 一般说来,色谱柱的理论塔板数越大,表示组分在色谱柱中达到分配平衡的次数越多,越有利于分离,但不能说明组分间分离的好坏,因为分离好坏决定于各组分在流动相和固定相之间分配系数的差别,而不是分配次数的多少。,41,无论是有效还是理论塔板数不能作为实际分离可能的依据。另一方面,塔板理论中有很多不合实际的假设,如:假定无纵向扩散、分配系数与浓度无关;再者,塔板

    13、理论不能解释塔板高度是受哪些因素的影响及流动相不同流速下测得的理论塔板数不同的事实。因而它有一定的局限性。,42,2速率理论1956年由荷兰学者范弟姆特把影响塔板高度的动力学因素与塔板理论结合起来,导出了塔板高度与流动相线速关系的方程。认为色谱峰的总扩张等于各独立因素对扩张影响之和;色谱柱的总板高等于各独立因素对板高贡献之和。即,式中A、B、C为常数,A为涡流扩散项,B为分子扩散项系数,C为传质阻力项系数。,43,(1)涡流扩散项在填充色谱柱中,当组分随流动相向柱出口迁移时,流动相由于受到固定相颗粒障碍,不断改变流动方向,使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动,故称涡流扩散。 填充柱的多孔

    14、性,引起的多径性与填充物的颗粒直径dp(cm)的大小和填充不均匀性有关。颗粒越大、填充越不均匀,涡流扩散就越严重,使板高增大。,44,(2)分子扩散项(又称纵向扩散项)B/u 组分在固定相和流动相中的浓差分子扩散。流动相的线速在分子扩散项中使板高减小,但分子扩散项系数使板高增大。表明B与组分在流动相的扩散系数和弯曲因子有关。流动相的粘度和相对分子量越小,组分在其中的扩散系数越大;温度越高扩散系数越大。弯曲因子与填充物有关,填充物的存在使分子自由扩散的能力降低;填充物填充的均匀性对弯曲因子影响不是主要的,只要有填充物存在,影响流动相路径弯曲的因素和减小分子扩散的因素就存在。,45,(3)传质阻力

    15、项Cu组分在固定相和流动相中移动的速率,包括:流动相和固定相传质阻力即两相对组分分子运动能力的影响。若传质阻力大,就会引起组分分子的超前和滞后,从而引起色谱峰的扩张。 对气相色谱的填充柱而言,有:,流动相传质阻力系数,固定相传质阻力系数,46,范底姆特方程:,该方程为气相色谱的板高载气线速方程,对分离条件的选择具有很好的指导作用,它说明了固定相粒度、填充均匀性、流动相种类及流速、柱温、固定相的特性等对柱效及峰扩张的影响。由此方程得到板高对线速的曲线。,47,6.5 典型制备色谱工艺及应用,1.模拟移动床色谱(SMBC),模拟移动床色谱技术,是模拟移动床技术与色谱分离技术的组合,是连续色谱的一种

    16、,属吸附分离技术。它是一系列色谱柱的串联,通过进样口与出样口定期变更,模仿填料的逆流,故称模拟移动床色谱。,48,模拟移动床( SMB)色谱的工作原理,对于传统的单柱色谱,假设是一个两组分分离体系,当脉冲进样后用适当的溶剂洗脱时就产生如图的效果:一个物质移动慢,另一个物质移动快,当色谱柱足够长时两者将最终分开。,49,在逆流模拟移动床的色谱分离系统中,可将固定相设想为是逆向于流体移动方向运动。待分离混合物在分离工作区中部的某一点被连续输入。选定双向流速比率,料液自入口处就分离成相互双向流动的两部分。以进料入口为参考点,吸附介质似乎吸附了产品向上移动,因此称“模拟移动床(Simulation M

    17、oving Bed, 简称SMB)”。在进料点以上的位置越高,产品纯度就越高,而副产品却是在相反方向富集。,50,51,SMB系统常可分为四个区,每区都有各自特有的流速。在相对于全程分离系统中,一旦达到稳定的浓度曲线,它将会在再循环流的助动下缓慢流过系统。在系统分离中保持浓度稳定是通过移动料液入口和解吸剂注入进口位置以及产品和副产品的出口位置来实现的,如下图所示。进出料位置的变换是由多孔旋转阀或自控阀来实现的。,52,移动床色谱示意图,53,应用实例(一) 模拟移动床色谱提纯槲皮素,原样品谱图 分离后产品谱图,54,SMB的优缺点:,优点:溶剂消耗大量减少;收集到的产品稀释度小;填料更加有效利

    18、用。 缺点:SMB是一种二元分离器,限制了它的应用范围;设备复杂,可能比HPLC更难使用和维护,一般要用816根性能相似的柱子,致使优化提纯条件更加复杂。,55,扩张床吸附(EBA)的操作步骤,包括平衡、进料、淋洗、洗脱等步骤,进料前必须实现稳定扩张,洗脱后进行清洗,除去吸附介质上附着杂质,56,未进行操作,介质沉降在柱下面,开始操作,泵入平衡液,实现稳定扩张,切换到进料,泵入料液,至吸附接近饱和,扩张床吸附操作步骤,切换到淋洗,泵入淋洗液,洗除残存杂质,洗脱,可以改变方向从上至下洗脱,再生清洗,57,扩张度:(受流体流速影响) 流速低,扩张度小,原料液中的固体颗粒通过床层困难,易滞留。 流速

    19、高,扩张度大,固体通过床层比较容易,,流速过高使介质上的吸附配基对目标产物的捕集效率下降. 一般控制流速:3cm/h, 扩张床高度是固定床的二倍.,58,床层高度增加,(1) 进料:,原料液浓度、粘度、固体颗粒含量与平衡液不同,床进行稳定扩张后,平衡液切换成原料液,59,在实际应用中,60,(2) 淋洗,多采用扩张床淋洗,a.目的:除去柱内滞留的细胞或细胞碎片,洗去部分吸附不牢的杂蛋白,b.淋洗缓冲液,粘度高,利于床层稳定, 利于流体以平推流流过床层, 较有效除去杂质颗粒,61,固定床洗脱 利于目标蛋白浓缩,扩张床洗脱 可以直接从扩张床淋洗切换,节省时间,(3) 洗脱,(I)床选择-固定床/扩

    20、张床,(II)洗脱剂选择,取决于吸附介质配基与目标产物相互作用特性,介质配基,产物,吸附特异性强,一种洗脱液,特异性差(离子交换和疏水作用介质),分段洗脱/梯度洗脱,62,(4)再生和清洗,非特异性吸附,使介质上吸附细胞、细胞碎片或杂蛋白.,每个操作周期末,都要清洗,恢复介质吸附容量,降低介质吸附容量,清洗操作:,对于扩张床,洗脱结束后,把床层扩张到堆积高度5倍左右,,提高清洗液的流速,冲去介质附着杂质,清洗液为偏酸、偏碱、含有有机溶剂或表面活性剂,清洗时间一般为3小时,63,吸附介质 扩张床介质易在流体自上而下的流动场中悬浮,并实现稳定。 1) 介质物性:介质颗粒尺寸及分布、密度及透水性。,

    21、流体流速和床扩张度,松散床层高度要求到达堆积高度23倍,2) 应用介质高交联度琼脂糖凝胶:适合吸附蛋白质类大分子,密度小,不易形成 稳定扩张床。 全氟碳化物乳胶:密度高,化学稳定性/生物相容性好,实心介质,比表面积小,不易形成稳定扩张床.,64,Streamline介质(Pharmacia): 球形大孔复合介质. 由结晶石英核和交联琼脂糖组成,石英核位于球形介质中心. 作用: 增加介质的密度,交联琼脂糖作用是提供大孔骨架和吸附表面。 允许流速范围:100300cm/h. 扩张床分离级数: 200级/m.,多孔玻璃珠(Bio-Rad):扩张床分离级数低,仍不理想。,65,扩张床吸附的优缺点: 优

    22、点:集固液分离、吸附、浓缩于一身简化操作步骤目标蛋白回收率高缺点:影响因素多,手工操作多,操作技能要求高操作时间较长,(淋洗、再生时间长)吸附介质价格高,比固定床介质高一倍.,66,所用柱内径为5.0厘米, 吸附剂固定床高22.3厘米, 膨胀床床层高度为固定床的2倍, 料液为25%的酵母细胞匀浆液, 膨胀空塔流速为96厘米/小时。 清洗液为含25%甘油A液; 洗脱液1为含0.05mol/dm3NaClA液; 洗脱液2为含0.15mol/dm3NaClA液; 洗脱液3为1.0mol/dm3NaClA液; A液为50mol/m3磷酸钠,pH6.0,1)膨胀床离子交换纯化葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH),纯化结果: 经一步膨胀床吸附纯化操作,除去了细胞碎片, 纯度提高11倍,收率达98%。,67,本章小结: 作业: 色谱的定义及其特点。 色谱分离过程的基本原理,不同色谱的分离机制。 有关色谱图的相关术语。 保留值、分离度和柱效率等基本概念。 模拟移动床的工作原理及其优缺点。,

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