1、山西太原药业有限公司诺氟沙星胶囊微生物限度检查法验证报告文件编码： TY-GSB-YZ（ 02）-013-04 二零一六年一月验 证 立 项 申 请 表立项部门 质量部 QC 申请日期 年 月 日立项题目 诺氟沙星胶囊微生物限度检查法方法学验证验证原因为确保检验结果的准确性，可靠性及检查方法的完整性，对产品检验方法进行方法学验证是极为重要的措施，因此，我们对本品的无菌检查法进行了方法学验证。验证要求及目的：按照 2015 年版中国药典四部通则微生物限度检查法规定内容进行验证。为确保检验结果的准确性和可靠性，定期对检验方法进行方法学验证是极为重要的措施。 立项负责人签名： 年 月 日质量保证部意
2、见 签名： 年 月 日验证小组负责人意见 签名： 年 月 日编制验证方案的人员：验证完成要求及日期：严格按照验证方案的内容进行试验并进行数据处理。要求在 年 月 日前完成。验证小组负责人签名: 年 月 日备注：目录1 验证目的 .12 范围 13 责任 14 内容 15 验证方法 15.1 供试品 .15.1.1 菌种名称及来源 25.1.2 培养基与试剂名称、批号及来源 25.1.3 仪器与设备 25.2 菌液的制备 .35.3 菌液计数 .45.4 计数培养基的适用性检查 .45.5 供试液 制备 .55.6 需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法验证 .65.7 控制菌检查方法验证 .76 试验结
3、论 87 偏差 97.1 偏差报告 .98 验证评价及建议 99 验证报告： 1010 验证证书 1021 验证目的根据中国药典2015 年版四部通则微生物限度检查法要求，为保证检验质量，确保检验结果的准确性和可靠性，对诺氟沙星的微生物限度检查法进行方法学验证。2 范围本验证方法适用于供试品的微生物限度检查法方法验证。3 责任 部 门 姓 名 职 责质量部 蔚晓娟 负责验证项目的申请、验证方案的编写和验证的实施质量部 李海晋 负责验证项目的实施质量部 张慧慧 负责验证项目的实施质量部 高彦红 验证小组负责人质量部 王雅玲负责验证方案的审核、项目立项的批准、验证的组织实施和验证报告的批准质量部
4、刘伯梅 负责验证报告的批准和偏差的调查4 内容验证方法需进行 3 个不同批次的产品验证并且结果都符合规定时，该方法才可以用于日后日常检验。5 验证方法根据中国药典2015 版四部通则微生物限度检查法5.1 供试品诺氟沙星胶囊 规格: 10ml 3批号 160101 160102 160103 5.1.1 菌种名称及来源枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 、 金黄色葡萄球菌 CMCC （B ）26003大肠埃希菌CMCC（B）44102 、 白色念珠菌CMCC（F ）98001黑曲霉CMCC（F）98003 铜绿假单胞菌 CMCC（B）10104以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供。5.1.
5、2 培养基与试剂名称、批号及来源胰 酪 大 豆 胨 琼 脂 培 养 基 151109 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 151112 沙 氏 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 151117 PH7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液 150313 以 上 培 养 基 均 由 北京三药科技开发公司 提 供 。5.1.3 仪器与设备SPX-250B-Z 生化培养箱： 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 MJX-250B-Z 霉菌培养箱： 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 5.2 菌液的制备（1）接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上
6、， 3035培养 1824 小时, 上述培养物用 PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数小于 100cfu 的菌悬液。（2）接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，2025培养 4872 小时，上述培养物用 PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数小于 100cfu 的菌悬液。（3）接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，2025培养 57 天，加 35ml 含 0.05%（ml/ml）聚山梨酯 80 的 PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢
7、子洗脱。然后采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05%（ml/ml）聚山梨酯 80 的 PH7.0 氯化钠-蛋白胨4缓冲液或 0.9%的无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数小于 100cfu 的孢子悬液。菌悬液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用，若保存在 28，可在24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在 28，在验证过的贮存期内使用。5.3 菌液计数取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌各小于100cfu 分别注入无菌平皿中，每株试验菌平行制备 2 个平皿，立即倾注不高于45的胰酪大豆胨琼脂培养基 1520ml，3035培养不超过 3 天。取白色念珠
8、菌、黑曲霉各小于 100cfu 分别注入无菌平皿中，每株试验菌平行制备 2 个平皿，立即倾注不高于 45的沙氏葡萄糖琼脂培养基约 1520ml，2025，培养不超过 5 天，培养计数见表 5.1表 5.1 活菌计数菌种名称 金黄色葡萄球菌大肠埃希菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉菌稀释级 10-6 10-6 10-6 10-6 10-5 10-61 88 93 83 76 73 622 74 84 89 82 64 74平均值 81 88.5 86 79 68.5 68菌液加入量 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml5.4 计数培养基的适用性检查取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌
9、、枯草芽孢杆菌、各 50100cfu 分别注入无菌平皿中，每株试验菌平行制备 2 个平皿，立即倾注不高于 45的胰酪大豆胨琼脂培养基 1520ml，3035培养 3 天。取白色念珠菌、黑曲霉各550100cfu 分别注入无菌平皿中，每株试验菌平行制备 2 个平皿，立即倾注不高于 45的沙氏葡萄糖琼脂培养基约 1520ml，2025，培养 5 天。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.52 范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。结果记录见表 5.2表 5.2 计数培养基的菌落数（1ml ）菌种名称培养
10、基名称金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌菌种名称培养基名称白色念珠菌黑曲霉平皿 1 85 82 90 平皿 1 81 83平皿 2 87 84 87 平皿 2 78 80胰酪大豆胨琼脂培养基平均值 86 83 88.5沙氏葡萄糖琼脂培养基平均值 79.5 81.5平皿 1 92 90 95 平皿 1 94 91平皿 2 93 89 91 平皿 2 90 94对照培养基平均值 92.5 89.5 93对照培养基平均值 92 92.5菌回收率 0.93 0.93 0.95 菌回收率 0.86 0.88根据表 5.2 结果判定培养基的适用性检查是否符合规定。5.5 供试液制备本品为抑菌型药物，需
11、氧菌、霉菌和酵母菌采用薄膜过滤法，取供试品10g(10ml)，加 PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或 PH7.2 磷酸盐缓冲液 ，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液 。若需要，调节供试液 pH值至 68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释。5.6 需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法验证65.6.1 试验组：取供试品上清液 1ml 加 0.1%无菌氯化钠-蛋白胨水溶液至 100ml，全量通过一次性薄膜过滤器，用 7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜 2 次（100ml/次） ，最后一次冲洗液加大肠埃希菌液 1ml，将滤膜贴至相应琼脂培养基平板上，培养。
12、5.6.2 菌液组取上述各菌液 1ml 用相应的培养基倒平板，每种菌液平行两皿。5.6.3 供试品对照组取供试液 1ml，加入 0.1%无菌氯化钠-蛋白胨水溶液 100ml，全量通过一次性薄膜过滤器，用 PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜两次，过滤两份，滤膜过滤面向上分别置于胰酪大豆胨琼脂培养基平板和沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，作为需氧菌菌和霉菌计数样品对照。5.6.4 稀释剂对照组取无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 100ml，过滤，用 PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗两次，每次 100ml，最后一次加入试液菌液，分别置于相应培养基平板上培养。5.6. 5 培养温度胰酪大豆胨琼脂培养基培养
13、温度 3035，培养时间 35 天，沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度 2025，培养时间 5 7 天。5.6.6 验证结果（回收率）计数方法适用性试验中，采用薄膜过滤法时，试验组菌落数减去供试品对照 组菌落数的值与菌液组菌落数的比值应在 0.52 范围内。结果记录见表 5.3 5.6.7 结论7根据上述各试验菌的回收率结果，最终判定检查方法是否适合供试品的需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法。5.7 控制菌检验方法验证5.7.1 控制菌检查用培养基的适用性检查菌液制备：同 5.2 项下制得菌液的方法。控制菌检查中所用培养基的适用性检查结果记录见表 5.4表 5.4培养基名称促生长能力 抑制能力 指示能力
14、麦康凯琼脂培养基分别接种不大于100cfu 大肠埃希菌液于麦康凯琼脂培养基和对照培养基中置 3035培养1872 小时，观察结果。用涂布法接种不大于 100cfu大肠埃希菌于麦康凯琼脂培养基和对照培养基平板上置3035培养 1872 小时，观察结果。检验结果麦康凯液体培养基分别接种不大于100cfu 大肠埃希菌于麦康凯液体培养基和对照培养基中置 4244培养2448 小时，观察结果。 分别接种不少于100cfu 金黄色葡萄球菌于麦康凯液体培养基和对照培养基中置 4244培养 2448 小时，观察结果。检验结果8根据实验结果判定以上培养基的适用性检查是否符合规定，是否可用于测定本品的控制菌检查。
15、5.7.2 控制菌检查方法验证5.7.2.1 试验组取供试液 1ml，加入 0.1%无菌蛋白胨水溶液 100ml，全量通过一次性薄膜过滤器，用 PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜两次，最后一次加入大肠埃希菌菌液 1ml，取出滤膜接入 100ml 胰酪大豆胨液体培养基中。5.7.2.2 阴性对照组取稀释液 1ml，加入 0.1%无菌蛋白胨水溶液 100ml，全量通过一次性薄膜过滤器，用 PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜两次，取出滤膜接入 100m 胰酪大豆胨液体培养基中。5.7.2.3 阳性对照组取大肠埃希菌菌液 1ml，加入 0.1%无菌蛋白胨水溶液 100ml，全量通过一次性薄
16、膜过滤器，用 PH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜两次，取出滤膜接入100m 胰酪大豆胨液体培养基中。5.7.2.3 培养取上述培养物 1ml，接种至 100ml 麦康凯液体培养基中，4244培养2448 小时，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，3035培养 1872 小时，若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。结果见表 5.5表 5.5 大肠埃希菌检查结果试验组 阴性对照组 阳性对照组大肠埃希菌 + - +根据表 5 的实验
17、结果，判定试验方法是否可用于本品的控制菌检查。6 试验结论9按照中国药典2015 版要求我们对 诺氟沙星胶囊 的微生物限度检查法进行了方法学验证。结果各项指标 符合 规定，证明本方案适合本品的微生物限度检查。7 偏差验证过程中如果出现偏差，应立即通知验证小组并对偏差进行详细记录，分析偏差产生的根本原因并提出解决方法。所有偏差得到有效处理后，验证方可进入下一步骤。7.1 偏差报告8 验证评价及建议验证评价：在整个验证工作中严格按照验证方案进行了验证，中间未对验证方偏差报告 偏差号偏差描述及建议的纠正措施验证人员签名 日期纠正措施的审核和批准QA 主任签名 日期结果跟踪QA 主任签名 日期是 否纠
18、正措施产生积极的效果？确认质量管理部年 月 日验证小组年 月 日10案进行修改，通过对诺氟沙星胶囊三个不同批次的微生物限度检查法验证数据及结果的评价分析，按照薄膜过滤法对本品进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数是可行的，按照验证的方法检查大肠埃希菌也是可行的。这次在整个验证过程中，较详细地填写了各种记录。建议：以后在本品检验过程中，须加强偏差的发现和分析，以便及时采取纠正和预防措施。评价人： 日期： 年 月 日9 验证报告：在验证领导小组的组织下，对诺氟沙星胶囊微生物限度检查法进行了验证，于 年 月 日开始按照验证方案实施了验证并于 月 日结束了验证工作。按验证方案的验证标准，对诺氟沙星胶囊的三批（批
19、号： 160101、160102、160103 ）分别进行了需氧菌、霉菌和酵母菌计数验证以及大肠埃希菌检查法的验证，通过对验证数据及结果的评价分析，按照薄膜过滤法对诺氟沙星胶囊进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数以及大肠埃希菌检查是可行的。在整个验证过程中，较详细地填写了各种记录。报告人： 日期： 年 月 日10 验证证书11验证证书编号：TY-JSB-YZ（06）-013-04 验证报告名称诺氟沙星胶囊微生物限度检查法验证验证项目按照验证方案所设计的标准，对产品的需氧菌、霉菌和酵母菌计数以及大肠埃希菌检查方法分别验证。验证要求及目的按验证方案的验证标准，对诺氟沙星胶囊三批（批号：160101、160
20、102、160103、 ）分别进行了需氧菌、霉菌和酵母菌计数验证以及大肠埃希菌检查法的验证，通过对验证数据及结果的评价分析，按照薄膜过滤法对诺氟沙星胶囊进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数以及大肠埃希菌检查是可行的。结论该验证项目及报告已经审核无误，予以批准，特此证明。再验证周期：本品在产品处方、生产工艺或检验方法变更时，需再做本品的微生物限度检查法的方法学验证。质量总监签名 : 年 月 日12表 5.3 表 5.3 诺氟沙星胶囊试验菌回收率测定菌落计数结果（ CFU/ml） 回收率试验组 菌液组供试品对照组试验菌供试品1 2 平均 1 2 平均 1 2 平均 试验组12 金黄色葡萄球菌312铜绿假单胞菌312枯草芽孢杆菌312白色念珠菌312 黑曲霉313
