1、金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。采用快速测试片检测具有显著的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。此方法现在应用于快速检测领域，美国3M 公
2、司 Petrifilm 为载体的测试片应用最为广泛。但其也存在一些问题：Petrifilm 测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm 测试片面积较小，当菌量大于250cfu 时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。使目视效果下降，导致计数偏低。2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两
3、种方法均能判断机体的感染状况。目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素 A、B、C 的抗体。毒素抗体优势在于敏感度高，易于检查，缺点毒素种类多，检测其中几种不具有普遍性。毒素分离工艺复杂，要得到纯毒素成本
4、比较高。（2）免疫学方法技术分析：上述免疫学技术应用最多的是酶联免疫技术和胶体金侧向层析技术。酶联免疫技术广泛应用于实验室检测，由于一次可以检测多个样本，此技术多用于体外诊断，目前也广泛用于食品安全。胶体金技术由于操作简单，检测适度快等优势，在食品安全领域广泛用于现场快速检测。基于免疫学方法的技术主要分为：酶联免疫技术、胶体金侧向层析技术、免疫荧光技术、免疫沉淀技术、乳胶凝集技术、免疫磁珠技术。3.分子生物学方法金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：肠毒素、血浆凝固酶、溶血素、杀白细胞素、表皮溶解毒素、毒性体克综合重量毒素 I 等。而这些致病因子基因的鉴定(包括耐药性相关
5、基因、毒素基因、酶基因及多种特异性鉴别基因)使得分子生物学检测成为近年来应用于食品中致病微生物快速检测的方法。基于分子生物学方法的技术主要分为：聚合酶链式反应 PCR 技术和实时荧光定量 PCR（rtPCR）技术、生物芯片技术、测序技术。分子生物学检测技术是检测技术的发展方向，是检测技术的未来，从DNA、RNA 角度深度检测。但是由于检测方法复杂，需要仪器设备及专业人员操作，对实验室环境有要求，检测成本高等因素，目前该技术没有广泛应用。针对市场上食品中金黄色葡萄球菌进行大批量的检测，是一件很不容易的事情。目前市场上还没有真正好的产品能够对金黄色葡萄球菌进行快速检测。首先要求检测速度快，目前的方
6、法大部分需要培养，至少2448小时，不利于现场检测，48小时以上商家才能拿到检测结果，才能进行市场销售，熟食就没有了新鲜度可言，所以检测速度成了菌类包括金黄色葡萄球菌检测的关键影响因素。其次是目前中国食品安全的重视度不够，一般市场没有相应的检测实验室和检测设备。上述需要仪器设备的检测方法完全行不通。熟食和冷藏食品中金黄色葡萄球菌数量很少，在10个以内，为快速检测增加了难度。而且人员素质低，专业人员比例少是客观存在的现实，不可能进行如分子生物学检测之类的实验，检测成本问题也不可忽视，百姓不希望在买菜的同时附加上一大笔检测费用。解决关键性问题可以提高检测速度，通过不断的研究和总结金黄色葡萄球菌快速
7、增殖的环境和条件，在增菌液中进行扩增，使菌数达到胶体金的检测下限，用胶体金方法检测，此方法检测时间为410个小时（其中金黄色葡萄球菌扩增时间为410小时，检测时间为3分钟） ，操作简单，不用任何实验室仪器设备，检测试剂盒价格低廉，比较适合金黄色葡萄球菌检测初筛。检测胶体金试剂卡分两种，一种是检测金葡菌肠毒素 ABC，另一种选取特异性菌壁蛋白，用基因工程方法合成抗原，对鼠进行免疫制出两株单克隆抗体，用双抗夹心法制成胶体金检测卡，对于金黄色葡萄球菌属检测率为96%。特异性实验证明与副溶血弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌小川型、O139型及569B 型等菌无交叉反应；假阳性率在5%以下、假阴
8、性率在1%以下；同一批次的试纸条10次重复试验结果一致。检测方法：将待检测食品取10g 食物样品在10%NaCl 溶液中涮洗5次，加入增菌液增菌（配合37手持小仪器使用可缩短增菌时间） ，加入菌裂解液摇匀，取3滴点板。结果判断如下图示：金黄色葡萄球菌仍然是食品安全的隐患，检测依然重要。人们吃上放心的食品是食品安全工作者的责任。希望今后能够继续开发出更好的金葡菌快速检测方法和检测试剂盒4 直接平板计数法（FDA BAM MRSE 为 33.8%,耐青霉素肺炎球菌（PRSP）为 26.6%,屎肠球菌(AREF) 对氨苄青霉素耐药率为 73.8%。大肠杆菌对各种喹诺酮类呈交叉耐药,耐药率高达 60%
9、。 多重耐药性 是指同时对多种抗菌药物发生的耐药性。是外排膜泵基因突变和外膜渗透性的改变及产生超广谱酶所致4，5 。最多见的是耐多药结核杆菌和耐甲氧西林金葡菌, 以及在 ICU 中出现的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌 ,仅对青霉烯类敏感;嗜麦芽窄食单胞菌几乎对复方新诺明以外的全部抗菌药耐药。 交叉耐药性 是指药物间的耐药性互相传递,主要发生在结构相似的抗菌药物之间。如目前大肠杆菌对喹诺酮类的交叉耐药率已超过 60%。 2 耐药性的产生及蔓延 细菌耐药性可通过在某一核苷酸碱基对发生突变，导致抗菌药物作用靶位的改变，或通过细菌 DNA 的全部重排，包括倒位、复制、插入、中间缺失或细菌染色体 DNA 的
10、大段序列的“转座子” 或插入顺序来完成，也可由质粒或其他遗传片段所携带的外来 DNA 片段，导致细菌产生耐药性4 。 质粒是一种染色体外的 DNA，耐药质粒广泛存在于革兰阳性和阴性细菌中，几乎所有致病菌都有耐药质粒。因此通过耐药质粒传递的耐药现象最为主要，也最常见。耐药质粒有两种主要类型，即接合型质粒和非接合型质粒。接合型质粒的耐药因子包括具有一个至数个耐药基因，通过改变细菌细胞壁或细胞膜的通透性，或阻断抗菌药到达作用靶位等作用，使细菌对抗菌药产生耐药的决定因子，以及负责耐药因子转移时所需物质的制备和合成的耐药转移因子。非接合型质粒的耐药因子仅有耐药决定因子而无耐药转移因子，故不能通过细菌接合
11、转移。 抗菌药有多种类型，但细菌在抵抗各个药物的作用时，可通过一种或多种途径对一种或多种不同类型的抗菌药产生耐药性。主要有： （1） 产生药物失活酶或钝化酶。 如 内酰胺酶 (-lactamase)使 内酰胺类抗菌药的酰胺键断裂而失去抗菌活性4，6 。目前最重要的 内酰胺酶是超广谱 内酰胺酶(ESBLs)、染色体异型酶(AmpC) 和 OXA。ESBLs 主要由质粒介导, 大约有 160 余种，分为TEM、SHV、OXA 等类型。 TEM 型由广谱酶 TEM-1 和 TEM-2 的基因发生突变，造成14 个氨基酸改变形成的一系列酶蛋白，目前大约有 70 余种。SHV 型有 30 余种，由广谱酶
12、 SHV-1 的基因发生突变，造成 14 个氨基酸改变而形成。OXA 型有 13 种，主要的水解底物是苯唑西林，故又命名为 OXA，是来源于 OXA-1、OXA-2 和 OXA-10 三种基因发生突变所至。ESBLs 主要在肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中发现，在肠杆菌属、变形杆菌属、沙雷菌属等其他肠杆菌科及铜绿假单胞菌中也多有发现。ESBLs 导致细菌对第三代头孢菌素、氨曲南及第四代头孢菌素耐药。AmpC 既可由染色体介导,也可由质粒介导,因对头孢菌素水解率高于青霉素类,故又称为头孢菌素酶,迄今已达 30 余种，已报道79的质粒介导 AmpC 型酶有 MIR-1、 ACT-1、 CMY-2、 LA
13、T-1、 LAT-2 等;OXA 是 ESBLs酶的一种，又称金属 内酰胺酶或碳青霉烯水解酶，能灭活青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类抗菌药,甚至能灭活酶抑制剂,包括克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等。 氨基苷类钝化酶是细菌对氨基苷类产生耐药性的最常见也是重要的机制。许多革兰阴性杆菌、金葡菌和肠球菌属等均可产生钝化酶，对氨基苷类分子结构中的氨基糖分子的活性基因进行修饰而使之失去抗菌作用。目前已知有乙酰转移酶(AAC)、磷酸转移酶(APH) 和核苷转移酶(AAD 或 ANT)3 类钝化酶。不同的氨基苷类可为同一种酶所钝化，而同一抗菌药又可为多种钝化酶所钝化。这是因为一种抗菌药的分子结构中可能存在多个结合点所
14、致。例如妥布霉素可为 6 种酶所钝化，庆大霉素可为 5 种酶所钝化，而阿米卡星则主要为一种 AAC 所钝化。 （2） 靶部位发生改变。 细菌可改变抗菌药与核糖体的结合部位而导致大环内酯类、林可霉素类和氨基苷类等药物不能与其作用靶位结合，也可阻断抗菌药抑制细菌合成蛋白质的能力。细菌对大环内酯类的耐药主要是因为核糖体 50S 的腺嘌呤残基转录后甲基化，使药物不能与核糖体结合而抑制了蛋白质的合成。细菌核糖体 30S 亚单位的 S12 蛋白可发生突变，使链霉素不能与核糖体结合而导致耐药。革兰阳性菌可由于其青霉素结合蛋白(PBPs)的改变，使其与 内酰胺类抗菌药的亲和力降低，导致细菌耐药。例如肺炎链球菌
15、可以从耐青霉素链球菌属中获得耐药基因片段与自身基因组合成镶嵌式耐药基因， 使之成为耐青霉素肺炎链球菌。金葡菌与屎肠球菌中的一些菌株可诱导产生新的 PBPs，与 内酰胺类的亲和力明显降低，造成细菌耐药。在淋病奈瑟球菌和流感嗜血杆菌等革兰阴性菌的某些菌株中也存在与 内酰胺类亲和力降低的 PBPs 而导致细菌耐药3 。 （3） 膜泵外排。 细菌普遍存在着主动外排系统，它们能将进入细胞内的多种抗菌药物主动泵出细胞外，导致细菌耐药。目前已知有 5 个家族、20 多种外排泵。主动外排系统首先是在大肠埃希菌对四环素的耐药机制研究中发现的。细菌中的主动外排系统可分为 4 类：MF 类、 RND 类、Smr 类
16、和 ABC 类。在铜绿假单胞菌、淋病奈瑟球菌、肺炎克雷伯菌、包皮垢分支杆菌、金葡菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、化脓链球菌等细菌以及白念珠菌中均存在主动外排系统。氯霉素、红霉素、氟喹诺酮类和 内酰胺类等抗菌药物均可由一种或数种主动外排系统泵出细胞外。 （4） 其他。如 建立靶旁路系统，使金葡菌产生青霉素结合蛋白 PBP2a，取代了固有的青霉素结合 蛋白 PBPs，与 内酰胺类抗生素的亲和力减低，致甲氧西林对金葡菌耐药； 改变代谢途径, 使抗菌药物与细菌生长所必须物质如叶酸结合,影响其生长繁殖;降低细胞膜(或壁)的通透性，导致细菌膜蛋白变性、膜孔蛋白缺损或形成生物膜，使亚胺培南对铜绿假单孢菌耐药等
17、9 。 通常情况下，由染色体介导的耐药性，耐药基因是由染色体编码介导,即 DNA 或 RNA 突变所致，耐药菌往往有一定缺陷，其特点是发生率较低(1/105)。但质粒( 又称 R-质粒) 介导产生的耐药菌则与敏感菌一样，特点是通过转化、转导、结合及易位等方式,其发生率高，通常表现在产生失活酶或修饰酶而耐药。可迅速生长繁殖，并可在正常人和体弱者中引起感染。无论质粒或染色体介导的耐药性，一般只发生于少数细菌中，难于与占压倒优势的敏感菌竞争，故其危害性不大。只有当敏感菌因抗菌药物的选择性作用而被大量杀灭后，耐药菌才得以大量繁殖而成为优势菌，并导致各种感染的发生。因此，细菌耐药性的发生和发展是抗菌药物
18、广泛应用，特别是无指征的过度使用和滥用的后果。 耐药基因和耐药菌株在人与人或人与畜之间均能够传播与蔓延。当一个病人感染耐药菌株，就可以成为重要的传播源。在医院，一个感染了 MRSA 的病人，往往成为其他许多人感染或带菌的来源。因此，在采取行动遏制耐药性时，除了应该考虑耐药性的出现，也必须考虑耐药菌株的传播。 单一微生物细胞能够携带耐药基因对付整个系列的、完全不相关的抗菌药物。例如引起痢疾的志贺菌，它的基因链的每一个耐药性编码都能对抗一种不同的抗菌药，所以它对任何一种抗菌药可产生耐药性。而且这一基因链能够从一个细菌细胞传递到另一个细胞。因此，一种以往敏感的志贺菌，在一次攻击过程中，就可以获取 5
19、 个或 6 个耐药基因。一个细菌在 24h 内可将耐药基因留下1,677,722 个后代，还横向传给其他细菌3，9 。 抗菌药物本身并不产生耐药性，只是在抗菌药物被不合理使用时才加剧这一过程。当抗菌药物自然选择有利于产生耐药性基因的细菌生存时，耐药性便产生了。所有抗菌药物的使用，无论适宜与否，都对细菌群有一种选择性的压力，而且抗菌药物使用越多，压力越大。所以，不适当地使用，包括药品的错误选择、剂量不正确或不良的治疗顺应性等都能造成耐药菌的产生。如肺炎，及时用青霉素治疗，肺炎链球菌就会被杀死，感染在耐药性出现之前得到治愈。然而，若药物剂量或给药间隔时间不准确，青霉素对肺炎链球菌的耐受突变株就有时
20、间产生、繁殖、并替代对青霉素易感的菌群，不仅治疗结果不好，而且使急性感染中的肺炎链球菌也就成了许多第一线药品的耐药菌。 据 WHO 最新估计，发达国家医院抗菌药物的使用率为30%，美国是 20%、英国是 22%。而我国抗菌药物的使用率为 60%70% ，过度使用和滥用的情况已很突出，细菌耐药问题也十分突出10，11 。葡萄球菌中耐甲氧西林的菌株已占金葡萄菌株的 64%，占凝固酶阴性葡萄球菌的 77%。这些细菌对青霉素类、头孢菌素类、红霉素、庆大霉素等常用抗菌药多数耐药。在我国目前用于 MRSA 治疗的药物主要用糖肽类、万古霉素、替考拉宁、链阳霉素和利奈唑烷。肠球菌的主要耐药问题是耐万古霉素的肠
21、球菌（VRE）和高耐氨基糖苷类的高耐药菌株（HLAR） 。全国 26 家医院，HLAR 占耐庆大霉素菌株的 60%80%，粪肠球菌与对万古霉素和替考拉宁的耐药率分别为2.95%、0.83%，屎肠球菌则为 5%和 3%。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌是易产超广谱 内酰胺酶（ESBLs）的主要菌株9http:/ 1994 年 ESBLs 分别为 10%和 12%，2000 年分别为 25%和 30%，2001 年分别为 35.3%和 32.7%。由于产 ESBLs 菌常对青霉素类、头孢菌素类和单酰胺类药物治疗不佳，使病死率升高。 另据国家细菌耐药性监测中心 2002 年的报告(60 余家医院)12，13
22、 。MRSA 的平均耐药率，1988 年为 34.8%，1999 年为 33.8%，2000 年为 29.7%。MRSA 对庆大霉素的耐药率为 65.7%，氯霉素为 44%，环丙沙星为 73.7%,红霉素为 89.1%,复方新诺明为 67%,四环素为 61%。 我国结核病人耐药率已达到 28.1%41.1% ，其中一部分病人对目前常用的抗结核药物已无效，成为长期细菌的感染源和结核控制中的一大难题。 3 耐药性的预防和遏制 抗菌药耐药性是一种自然的生物学现象，是细菌等微生物受到抗菌物药使用的选择性压力的反应。最主要的办法是预防感染，其后才是遏制问题。自从抗菌药使用以来，它就促使了耐药性的产生，因
23、此，任何遏制战略都应该归结于尽量减少抗菌药物不必要、不适当或者不合理的使用。 对于药耐药性的产生，医院是一重要环节，因为高度易感染病人常常需要延长抗菌药治疗，并出现交叉感染的问题。每家医院都应该遏制和控制多重耐药菌的高发比例，有效的控制医院感染，具体的做法是： （1）建立良好的微生物实验室，并发挥其诊断服务的重要作用。 （2）加强抗菌药物处方的管理，限制抗菌药临床适应证范围。 （3）预防多重耐药菌在院内的传播，加强院内感染的控制。（4）提高患者正确使用抗菌药的认识，即抗菌药不能随便用。用抗菌药来对付感冒，基本上是没有用的。 （5）抗菌药使用的原则是能用窄谱的就不用广谱的，能用低级的就不用高级的
24、，用一种能解决问题的就不要几种联合用。 （6）一般情况下，不要为了预防而使用抗菌药，特别是广谱抗菌药。还要避免外用青霉素类、头孢菌素类及氨基糖苷类抗生素，不要把这些抗菌药配成液体冲洗伤口，避免诱发耐药细菌的产生。 （7）严格控制抗生素的预防使用和非医疗中农、林、牧、副、渔以及饲料的抗生素使用。 （8）采取限用策略，如轮作制，即将某些抗菌药停用一段时期后再用，以恢复细菌对药物的敏感性。 （9）根据药效学/药动学（PK/PD）特征制订方案等1416 。 抗菌药分为浓度依赖型和时间依赖型二种类型，所以在根据 PK/PD 参数制订给药方案时，也有较大的不同。浓度依赖型抗菌药，浓度越高杀菌力越强，如喹诺
25、酮类、氨基糖苷类、两性霉素 B 和甲硝唑等。其药效学参数是：24h 药物浓度时间曲线下面积（AUC）/MIC ，即 AUIC125250 时不但起效快,且能有效地杀灭细菌和抑制耐药菌株产生,临床有效率可达90%，故应该大剂量每日 1 次给药。以及血清药物峰浓度（Cmax）/MIC 的比值812 。如氨基糖苷类为每日 1 次,喹诺酮类为每日 12 次为宜。研究表明，如果喹诺酮类的 AUIC100 时，细菌即使未被清除，其对药物的敏感率仍维持在 90%以上；倘若 AUICMIC） ，其持续时间应超过给药间期的 40%50%。不同菌种要求给药间隔时间的百分比不同。头孢菌素类的最佳疗效为 TMIC 6
26、0%70%,青霉素为 50%。所以，时间依赖型抗菌药需要每日多次给药，或持续滴注，以维持 MIC 在间隔时间的 50%60% 内，避免诱发耐药细菌的产生。 根据药物的 PK/PD 参数制定给药方案，以 MIC 为依据的抗菌治疗策略，除了有效地消除感染外，对阻止耐药突变菌株被选择而导致耐药率上升有着重要作用。近年来在对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和结核杆菌等的研究中，提出了防“突变浓度”（MPC ） 、关闭或缩小“突变选择窗”(MSW) ，最大限度的延长 MSW 的新概念。所谓 MSW 就是 MPC 与 MIC 之间的范围,即以 MPC 为上限，以 MIC 为下限的浓度范围。MPC 是防止耐药突变
27、菌株被选择所需的最低抗菌药物浓度，或是抗菌药物的阈值浓度，即耐药菌株突变折点15，17 。 MSW 为可产生耐药菌株的范围，MSW 越宽越可能筛选出耐药菌株，MSW 越窄，产生耐药菌株的可能性就越小。如药物浓度仅仅大于 MIC,容易选择耐药菌株。为此,欲防止耐药菌株产生,在选择药物时,应选择药物浓度既高于 MIC,又高于 MPC 的药物,这样就可关闭MSW,既能杀灭细菌,又能防止细菌耐药。研究证实,氟喹诺酮类的 MPC 一般保持在 MIC 的7 倍以上,就可避免选择出耐药菌。如莫西沙星的 AUC/MIC 之比是加替沙星的 2 倍,是左氧氟沙星的 6 倍。所以治疗药物浓度高于 MPC，不仅可以获
28、得成功的治疗，而且不会出现耐药突变。凡是 MPC 低、MSW 窄的药物是最理想的抗菌药物，或者药物在 MSW 以上的时间越长越好，如莫西沙星在 MSW 以上的时间长达 24h，吉米沙星为 14h，加替沙星为6h，左氧氟沙星只有 3h10，12 。 细菌耐药性是细菌进化过程的自然界规律，也是病原微生物与抗菌药物之间永恒的矛盾。人类要想减少病原微生物对自身健康的威胁，必须制定和采取合理使用抗菌药物的严格措施，包括研究开发新药、制定管理法规和提高用药水平等。避免人类被迫回到抗菌药物前的年代。 【参考文献】 1 戴自英，刘裕昆，汪复 .实用抗菌药物学,第 2 版.上海：上海科学技术出版社，1998，2
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