1、毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核
2、生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖
3、快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题1。与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。虽然干扰素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而
4、大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的维特，因此引起产量下降。同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的下降。为克服酿酒酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统2。甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida 等以 Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点1、2、3； 具有醇氧化酶 AO
5、X1 基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。 表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。（即同源重组） 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。Pichia.pastoris 基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子 AOX1，已高效表达了 HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素 C 片段、基因工程抗体等多种外源基因，证
6、实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜子扩大为工业规模4。目前美国 FDA 已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的 Cephelon 制剂已获得 FDA 批准，所以该系统被认为是安全的 Pichia.pastoris 表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品2、3。近年来，Invitrogon 公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经有 300 多种外源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统。 毕赤酵母宿主菌常用的有 GS
7、115 和 KM71 两种，都具有 HIS4 营养缺陷标记。其中，GS115 茵株具有 AOX1 基因，是 Mut，即甲醇利用正常型；而 KM71 菌株的 AOX1 位点被 ARG4 基因插入，表型为 Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。Pichia.pastoris 酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达5包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。表达载体都是穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞。为使产物分泌胞外，表达载体还需带有信号肽序列。毕赤酵母表达系统有多
8、种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效分泌表达。胞外表达需要在外源蛋白的 N 末端加上一段信号肽序列，引导重组蛋白进入分泌途径，可使蛋白蛋白质在分泌到胞外之后获得准确的构型。毕赤酵母对外源蛋白自身的信号序列识别能力差，在本试验中所使用 pPICZA 质粒，其信号肽来自酿酒酵母的 -交配因子（-factor），能很好的达到以上的要求。并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有 Zeocin 抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利1、2。pPICZA 质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点简介如下： 具有强效可调控启动子 AOX1（alcoh
9、ol oxidase，醇氧化酶）； 具有 Zeocin 抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用 Zeocin 进行筛选，即在YPDZ 平板上生长的转化子中，100都有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程5。在操作过程中，Zeocin 也可用来筛选含表达载体 pPICZA的大肠杆菌转化子，不必另外使用 Amp，经济而又简便；。 在表达载体 A0X1 5端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多克隆位点下游有 A0X1 3端终止序列； 分泌效率强的信号肽 -factor.Invitrogen 公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为广泛的酵母表达系统，其主要的优点
10、有：醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高。外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在。同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且，有利于产物的纯化。一毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制11 各种母液的配制10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的 13.4%酵母基础氮源培养基） 4保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g 硫酸铵，溶于 1000ml 水中，过滤除菌。500*B （0.02%生物素 Biotin） 4保存 保存期为 1 年。20mg 的生物素溶于 100ml 水中，过滤除菌。100*
11、H （0.4%Histidine 组氨酸） 4保存 保存期为 1 年。400mg 的 L-组氨酸溶于 100ml 水中，（加热至 50以促进溶解），过滤除菌。10*D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期为 1 年。200g 葡萄糖溶于 1000ml 水中，灭菌 15min 或过滤除菌。10*M （5%Methanol 甲醇） 保存期为 2 个月。将 5ml 的甲醇与 95ml 水混匀，过滤除菌。10*GY （10%Glycerol 甘油） 保存期为 1 年以上。将 100ml 甘油和 900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。100*AA （0.5% of each Amino Acid
12、，各种氨基酸） 4保存 保存期为 1年。分别将 500mg 的 L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和 L-异亮氨酸溶于 100ml 水中，过滤除菌。1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将 1mol/L 的 K2HPO4 溶液 132ml 与 1mol/L 的 KH2PO4 溶液 868ml 混匀，其 pH 为 6.0，如需调节 pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节 pH。1.2 常用溶液及缓冲夜1.2.1 碱裂解法抽提质粒 DNA 所用溶液：溶液：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L
13、 TrisHCI (pH 8.0)溶液：0.2molL NaOH，1 SDS（临用时配制）溶液：29.44g KAc，11.5ml Acetic acid，加 ddH2O 至 100 ml。4保存。1.2.2 10% 甘油 （Glycerol）：将 100ml 甘油和 900ml 水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。保存期为 1 年以上。1.2.3 Rnase-H2O：1ul Rnase 加入 1ml 灭菌 dd H2O。4保存。1.2.4 TE 缓冲液：10mmol / Tris-CI（pH 80）， lmmol / L EDTA（pH 8.0）1.2.5 STE 缓冲液：0.1mol / L,
14、10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0)1.2.6 SCE 缓冲液：1mol / L Sorbitol (山梨醇), 10mmol / L 柠檬酸钠 ， 10mmol / L EDTA1.2.7 1M potassium phosphate buffer （pH 6.0）：132 ml 1M K2HPO4868 ml 1M KH2PO41.2.8 50X TAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH 8.0（1L）：242 g Tris 57.1 ml Acetic Acid 37.2 g EDTA二毕赤酵母表达的培养基配制52.1 LB
15、（LuriaBertani）培养基： Trypton lYeast Extract 0.5NaCl lPH 7.0制作平板时加入 2琼脂粉。121高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZA 原核宿主菌 TOP10F时可加入 Zeocin 25ug / ml。2.2 LLB（Low Salt LB）培养基： Trypton lYeast Extract 0.5NaCl 0.5PH 7.0制作平板时加入 2琼脂粉。121高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养 pPICZA 原核宿主菌 TOP10F时，加入 Zeocin 25ug / ml，可以 4条件下保存 12 周。2.
16、3 YPD （又称 YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 g/ml液体 YPD 培养基可常温保存；琼脂 YPD 平板在 4可保存几个月。加入 Zeocin 100ug / ml，成为 YPDZ 培养基，可以 4条件下保存 12 周。2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextro
17、se Medium）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol 1 M+agar 2%+ Zeocin 100 g/ml不管是液体 YPDS 培养基，还是 YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放 4条件下，有效期 12 周。2.5 MGY Minimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将 800ml 灭菌水、100ml 的 10*YNB 母液、2ml 的 500*B 母液和 100ml 的 10*GY 母液混匀即可，4保存，保存期为 2 个月。2.
18、6 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸）在 1000ml 的 MGY 培养基中加入 10ml 的 100*H 母液混匀，4保存，保存期为 2 个月。2.7 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L 的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）1. 将 186g 的山梨醇定容至 700ml，高压灭菌；2. 冷却后于 45水浴；3. 将 100ml 的 10*D、100ml 的 10*YNB；2ml 的 500*B
19、；10ml 的 100*AA 等母液和88ml 无菌水混匀，预热至 45后，与步骤 2 的山梨醇溶液混合。4保存。2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸）在 RD 培养基配制的第三步中，在加入 10ml 的 100*H 母液，同时无菌水的体积减少至 78ml 即可，其余配制方法与 RD 相同。4保存。2.9 RD 及 RDH 平板的制备1. 将 186g 的山梨醇和 1520g 琼脂粉定容至 700ml，高压灭菌；冷却后于 60水浴；2. 参照 RD/RDH 液体培养基配制的步骤 4，将 100
20、ml 的 10*D、100ml 的10*YNB；2ml 的 500*B；10ml 的 100*AA 等母液、（10ml 的 100*H 母液）和88（78）ml 无菌水混匀，预热至 45后，与步骤 1 的山梨醇/琼脂液混匀；3. 迅速制备平板。4可保存数月。2.10 RD 及 RDH 的 TOP 琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）1.将 186g 的山梨醇和 7.510g 琼脂粉定容至 700ml，高压灭菌；冷却后于 60水浴；2.参照 RD/RDH 液体培养基配制的步骤 4，将 100ml 的 10*D、100ml 的 10*YNB；2ml的 500*B；10ml 的 100*AA 等母液、（
21、10ml 的 100*H 母液）和 88（78）ml 无菌水混匀，预热至 45后，与步骤 1 的山梨醇/琼脂液混匀；3.将该 TOP 琼脂置于 45水浴冷却、保温，备用。2.11 MD 与 MDHMinimal Dextrose Medium +（Histidine） 最小葡萄糖培养基 +（ 0.004 %组氨酸）（含有：1.34%YNB；4*10-5% 生物素；2%葡萄糖）1. 100ml 的 10*YNB；2ml 的 500*B 和 100ml10*D 母液，用 800ml 的无菌水定容至1000ml 即可；2. 如配制 MDH，可在上述的 MD 中加入 10ml 的 100*H 即可；3
22、. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入 1520g 的琼脂。4可保存数月。2.12 SOC 培养基：Trypton lYeast Extract 0.5NaCl 0.05Glucose (1mol / L) 2%121高压灭菌 20min，冷却后，4保存三主要试验环节的操作3.1 酵母菌株的分离纯化接种 GS115 于 5ml YPD 液体培养基，30，200rpm 振荡过夜，涂布 YPD 平板，30培养 48 小时，用 YNB 基本培养基和含 His 的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划 YPD 平板，4保存。3.2 pPICZA 原核宿主菌
23、TOP10F的活化培养TOP10F做为菌种保存在70 条件下，在进行扩大培养抽提质粒之前，先要进行活化培养。接种 TOP10F于 5ml LLB（加入 25ug / ml Zeocin）中，37，200 rpm ，培养1618 小时。3.3 毕赤酵母表达的试验方法3.3.1 线状质粒 DNA 的脱磷酸化处理为了防止载体质粒 DNA 的自身环化，用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理酶切后的质粒 DNA，具体操作如下： 建立反应体系：线性化的质粒 35ul10x CIP buffer 4ulCIP 1ulddH2O 5ultotal 45ul 在 PCR 仪上控制反应温度（加石蜡油封闭），37，15
24、min ；50，15 min；56，30 min（灭活）。 在 56未开始前停止，加入 proteinse K ，用于灭活 CIP，加入试剂如下：反应物 45ul10x 5 SDS 7ul10x EDTA （pH 8.0） 7ulproteinse K 5ulddH2O 6ul total 70ul 纯化使用 QIAquick spin kit ，按照 2.2.3.3 步骤进行，20 ul 灭菌 ddH2O 洗脱纯化产物。进行 1琼脂糖凝胶电泳，120 V， 观察纯化结果，并大约估计 DNA浓度。3.3.2 E.coli TOP10F 感受态细胞的制备及转化 取 10 ul TOP10F 菌液
25、，接种于 200ml LB 液体培养基中活化培养，37 ，200 rpm，1618 小时。取 100 ul 菌液接种于 200 ml 液体 LB 培养基中。 37 ，200 rpm，培养 1618 小时。 灭菌 500 ml 离心管，4，4000 rpm，20 min 。得菌体沉淀。弃上清，菌体用 10甘油重悬并洗涤。重复洗涤 3 次。 第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约 1ml 液体用于重悬菌体。 从制得的感受态细胞中，取 200 ul 于灭菌 EP 管中，加入连接反应产物 5ul ，混匀，不要产生气泡，在冰上放置 5 min。 将混匀后得 200ul 菌液移入电击杯中。 使用电击穿孔仪进
26、行转化，设置为 电压 2500 V，时间 5 ms。 电击后，往电击杯中加入 800ul SOC 培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌 1.5 ml EP 管中。37，150 rpm ，轻摇 4560 min。 取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的 LLBZeocin 平板上，正放，待涂布液不在流动，37 培养 1216 小时。*注：设空载体做对照。3.4 毕赤酵母电转化方法3.4.1 菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有 5ml YPD 培养基的 50ml 三角瓶中，30、250300r/min 培养过夜；2. 取 100500l 的培养物接种至含有 500ml 新鲜培养
27、基的 2L 三角摇瓶中，2830、250300r/min 培养过夜，至 OD600 达到 1.31.5；3. 将细胞培养物于 4，1500g 离心 5min，用 500ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4. 按步骤 3 离心，用 250ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；5. 按步骤 3 离心，用 20ml 的冰预冷的 1mol 的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6. 按步骤 3 离心，用 1ml 的冰预冷的 1mol 的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为 1.5ml；7. 备注：可将其分装为 80l 一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2 周之内）。3.4.2 电击转化：8. 将 5
28、20g 的线性化 DNA 溶解在 510l TE 溶液中，与 80l 的上述步骤 6 所得的菌体混匀，转至 0.2cm 冰预冷的电转化杯中；9. 将电转化杯冰浴 5min；10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；11. 电击完毕后，加入 1ml 冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至 1.5ml 的 EP 管中；12. 将菌体悬液涂布于 MD 或 RDB 平板上，每 200600l 涂布一块平板；13. 将平板置于 30培养，直至单个菌落出现。推荐：电压 1.5kV；电容 25F；电阻 200。电击时间为 410msec。3
29、.5 Pichia 酵母表达直接 PCR 鉴定重组子的方法3.5.1 模板的处理：1. 平板上的菌落长到肉眼可见时（约 12 小时）；2. 将除了模板之外的其它 PCR 反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用 Kit中已有的检测专用的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；3. 用半根灭菌的牙签（节约，而且好用）挑取菌落，在 PCR 管中涮以下，放入一个灭菌的 1.5 毫升离心管，对 PCR 管和 1.5 毫升离心管编号；4. PCR 扩增，1 agarose 电泳；5. 对于 PCR 扩增显现特异性条带的克隆，把置于 1.5 毫升离心管中
30、的半截牙签扔到 5 毫升 YPDZ 培养基中，30 度培养，812 小时后提质粒，酶切鉴定确认。 注意：本试验方法应用在需要挑取的克隆较多（也就是克隆效率低），使用 PCR 初筛可以使工作量大为降低。3.5.2 PCR 反应体系：以 TaKaRa Taq DNA 聚合酶反应为例：组分 50l 体系 20l 体系10xReaction Buffer 5.0l 2.0l25mmol/L MgCl2 3.0l 1.2l2.5mmol/L dNTPs 5.0l 3.0lPrimer 1（10mol/L） 2.5l 1.0lPrimer 2（10mol/L） 2.5l 1.0lddH2O 31.5l 1
31、2.6lTaq DNA 聚合酶 0.5l 0.2lTOTAL 50.0l 20.0l3.5.3 PCR 反应条件：初始变性 94 4min 变性 94 30s 34 个循环退火 5054 30s 延伸 72 30s 结束延伸 72 10min 保存 4 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 接种重组和空质粒转化子于 5ml YPDZ 培养基， GS115 菌于 YPD 培养基作对照，30，培养 1618 小时。 室温下，1500 g 离心 5-10min 收集菌体 100 ulTE（pH 7.0）重悬，加入 300 ul EDTA（pH 8.0），0.07M TrisHCl，3 ul-巯基乙醇，1u
32、l Lyticase ，37水浴 30 min。 10000g 离心 510min，取沉淀，加 90ul TE 重悬。 200ul 饱和酚，200ul 氯仿，混匀，离心 30s ，取上层水相。 加入两倍体积无水乙醇以及 1/10 体积的 NaAC，-20放置 30min； 10000g 离心 20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次； 干燥后，加入 15 l 的 TE 或 H2O 溶解，-20备用。3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验1. 挑选一单菌落，置于装有 25ml MGY、BMG 或 BMGY 培养基的 250ml 摇瓶中，于28-30C/250-300 rpm 培养至 OD6
33、00 = 2-6 (16-18 h)；2. 室温下 15003000g 离心 5min，收集菌体，用 MM、BMM 或 BMMY 重悬菌体，使OD600 =1.0 左右（约 100200ml）；3. 将步骤 2 所得的菌液置于 1L 的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于 28-30C/250-300 rpm 的摇床上继续生长；4. 每 24h 向培养基中添加 100 甲醇至终浓度为 0.51.0%；5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为 1ml，置于 1.5ml EP 管中，最大转速离心23min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、6、12、24
34、、36、48、60、72、84 和 96h；6. 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80C 保存备用；7. 可以用 SDS-PAGE、Western-Blot 及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。3.7 Muts 表型重组酵母的诱导表达实验1. 挑选一单菌落，置于装有 25ml MGY、BMG 或 BMGY 培养基的 250ml 摇瓶中，于28-30C/250-300 rpm 培养至 OD600 = 2-6 (16-18 h)；2. 室温下 15003000g 离心 5min，收集菌体，用 1/5 到 1/10 原培养体积的MM、B
35、MM 或 BMMY 重悬菌体（约 1020ml）；3. 将步骤 2 所得的菌液置于 100ml 的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30C/250-300 rpm 的摇床上继续生长；4. 每 24h 向培养基中添加 100 甲醇至终浓度为 0.51.0%；5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为 1ml，置于 1.5ml EP 管中，最大转速离心23min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、24、48、72、96 和 120h；6. 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80C 保存备
36、用；7. 可以用 SDS-PAGE、Western-Blot 及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。四 试验的注意事项4.1 信号肽识别位点的设计以质粒 pPICZA 为例。在利用 PCR 反应在外源基因两端引入酶切位点的试验中。如果质粒 pPICZA 双酶切中丢失了 KEX2 蛋白酶的酶切位点 LysArg，应该在上游中，增加了编码 Lys、Arg 的密码子 AAA、AGA 。酵母细胞膜中中的 KEX2 蛋白酶是 -factor 信号肽的切割酶，它能有效识别酶切位点 LysArg，通过对信号肽的切割使基因表达产物释放至胞外。4.2 PCR 产物酶切保护碱基的设计利用 PCR 转换酶切位点，通过
37、 P3、P4 两引物的扩增在 rhEGF 的两端加上Xho、Xba的识别位点和 5 个保护碱基。根据限制性核酸内切酶的工作原理，内切酶首先需要结合到核苷酸序列上，并在上面进行滑行，直至识别到酶切位点，为了能使内切酶有效的结合到序列上以利于其的有效加工。在利用 PCR 进行酶切位点转换的时候，通常应在 5端限制酶位点外再加 3 个保护碱基 GC6，防止引物合成中因为合成效率和纯化问题而导致的酶切位点的残缺。核苷酸保护碱基之为了保证限制型内切酶的工作效率，在其识别位点的两侧应该保证一定的旁侧序列，换言之，识别位点是限制型内切酶识别并特异性切割底物的必要而不充分的条件。鉴于 NEB(New Engl
38、and Biolabs)公司在限制酶领域的总体研究水平和对保护碱基方面的独到理解，在设计引物时可以参照 NEB 公司的产品目录后面的附录：Cleavage to the end of DNA fragments 进行7，但是，一些不常用的酶或虽有推荐的保护碱基序列但酶切效率仍不高的酶还是很难设计保护碱基。本次实验中，根据美国基因动力实验室文献的报道8；XbaI、NheI 和 SpeI 位点 5端保护碱基须在 5 个左右才容易被酶切割，以及一些前人的经验总结，我们在设计引物时在识别位点 5端，设计了 5 个保护碱基。以保证较高的酶切效率。4.3 高保真 DNA 聚合酶的使用Vent DNA 聚合
39、酶是从高温嗜热菌中分高出的高保真（High Fidelity）耐高温 DNA 聚合酶，能纠正 DNA 扩增中产生的错误，而传统的 Taq DNA 聚合酶，Tth DNA聚合酶及其变体 AmpliTaq，KlenTaq 等都无 3至 5纠错功能，因此在扩增时出现碱基错配的机率为 2.1x104。这对于大批量的 PCR 产物而言，并不是十分严重的问题，因为又同样错误的 DNA 分子仅占全部合成的 DNA 分子群体的极少一部分。但是，如果 PCR 扩增的 DNA 片段是用于分子克隆，那么这就是件值得重视的事情，因为此种分子含有一个或数个错误掺入的核苷酸，那么在该克隆中的所有克隆 DNA 都将带有同样
40、的“突变”。将会导致严重的后果9。具有校正功能的 DNA 聚合酶还有 Pfu，Deep Vent，Pwo，UlTma 等，Pfu 是其中出错率最低的，比 Taq DNA 聚合酶低 10 倍。在本论文中，为了减少 hEGF 在 PCR 过程的错误扩增，在人工合成 hEGF 的过程中使用了 Vent DNA 聚合酶。随着 PCR 技术的不断发展成熟（扩增长度、保证性、产量和特异性等），质粒构建过程的大多数细胞内的 DNA 复制将被 PCR 这一细胞外的 DNA 复制所代替，质粒构建效率将有质的飞跃。4.4 密码子的偏好性的原则酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。了解表达系统宿主在密
41、码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析外源基因表达的规律有重要意义,也为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据10、11。4.5 线性化及采用电转化的原因：在 pPICZA-EGF 电转整合入 GS115 的时候，因为需要比较高的转染率，我们对其用限制性内切酶 Sac进行线性化的处理。细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程的难点。因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，所以重组转移载体必须用特定的限制性内切酶进行线性化处理。这种处理的目的： 防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活； 让同源重组以指定的方式发生。4.5 乙醇沉淀法的问题主要步骤如下：1）酶切体系（80ul）
42、中 2 倍体积的无水乙醇加 1/10 体积的 PH5.2 NaAC，混匀2)-20 20 分钟沉淀3)13200rpm，20min，离心后弃上清4)75%乙醇 300ul 轻轻洗，同上离心 5min，弃上清5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。6)20ul ddH2O 重溶如果想提高转化效率，可以稍微做一些改进：1. 还是用酚抽一下，去除内切酶；2. 75%乙醇应洗两遍，尽可能去除盐离子，防止电转化杯被击穿，同时可提高效率；3. 在沉淀时，如用终浓度 2.5M 的醋酸钠+2.5 倍体积的无水乙醇，可沉淀几乎所有的 DNA，但需要用 75%的乙醇认真的洗两遍。4.6 酶
43、切的总结影响重组质粒构建效率的最关键步骤在于酶切，不管是否是定向克隆还是非定向克隆。酶切的关键在于切干净，彻底的酶切反应是成功的一半，特别是载体的酶切，尤其是双酶切。 双酶切一般是先反应低盐 buffer 的、后反应高盐 buffer 的，如果低盐 buffer 的酶在高盐 buffer 的酶的反应条件下有低活性（一般来讲在 NEB 的手册上都有标示），最好就先纯化（酚/氯仿抽提、乙醇沉淀）过，再进行第二次酶切反应。注意：有相同功能（如：切同一序列，并产生相同末端）的酶，不一定是相同的酶（结构、性质不同）。双酶切失败有很多原因，先要看你抽的质粒有没有问题，你可以用 23 种确定单酶切的酶分别切
44、质粒，如果都只有一条带就没问题；再看你的双酶切的缓冲液是不是合适，如果你的双酶切条件不对，就会有大小不同的片断。有时候提供给你的缓冲液的理论值与实际有很大的差别。建议你回头检查一下你的质粒超螺旋是不是很好，酶切实在不行的话，就分开来切，顺便检查你的那一个酶，或者那一个酶切有问题。抽提质粒要注意溶液处理时间不要超过 5 分钟，太长会有部分质粒不能复性，而且酶切不动。酶切反应成功的前提是对质粒载体的大致定量，太多的载体用量对酶切效率有负面影响，而太少的质粒载体不能保证实验的需要。4.7 如何减少 PCR 反应中的引物二聚体减少引物形成二聚体的可能性：1.退火温度设置不对，导致引物与模板的结合率降低
45、。2.引物设计不好，很容易形成二聚体。如果碰到这种情况，可以尝试从以下几个方面解决：设计引物的时候首先要熟悉引物设计的一般的原理，参考一些资料，积累经验。如果条件允许的话，可以用比较靠得住的引物设计软件验证我的引物，如果没问题，则进行下一步。改变退火温度一般引物合成后厂家会提供其 Tm 值，可以根据这个温度为基准来做温度实验。如果你设计的引物里头有酶切位点和保护碱基，则此方法不行，可以用比较靠得住的引物设计软件来计算你引物中与模板结合部分的 Tm 值，然后以此为基准做温度实验。也可以根据自己的实际操作经验来解决问题。最后建议换一下 Taq 酶，某些进口的 Taq 酶太严谨，导致引物二聚体的形成
46、，这也是可能的。我们试验中一直都是使用某国产的 Taq 酶，效果挺理想。参 考 文 献1 李晶，赵晓祥，沙长青等。甲醇酵母基因表达系统的研究进展。生物工程进展 1999，19（2）：17-202 欧阳立明，张惠展，张嗣同。巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展。生物化学与生物物理进展 2000，27（2）：151-1543 彭毅，杨希才，康良仪。影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。生物技术通报2000，4：33-364 杨晟，黄鹤，章如安。重组人血清蛋自在 Pichia pastoris 中分泌表达影响因素的研究。生物工程学报 2000，16 （6）：675-6785 EasySelect Pich
47、ia Expression Kit，Catalog no.K1740-01，Invitrogen6 美Sambrook.J 等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社 20027 Cleavage to the end of DNA fragments，New Egland Biolabs。（http:/）8 美国基因动力实验室 基因高效快速表达试剂盒简介http:/ 基因工程原理 吴乃虎 北京 科学出版社 第二版 1998 10 姚斌等。高效表达具有生物学活性的植酸酶的毕赤酵母。中国科学(C 辑) 28（3）： 237-24311 涂宣林，宋后燕。Ppastoris 高效表达外源蛋白的研究进展。(http:/ 1998，18（4）：1921
