1、荧光原位杂交Fluorescence In Situ Hybridization 杂交原位杂交荧光原位杂交核酸分子杂交 原理： 把亲源关系较近的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。 依据DNA 双链碱基互补、变性和复性原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列。核酸分子杂交分类核酸分子杂交固相杂交 探针 被测DNA（RNA）在固体支持物上杂交液相杂交 探针 被测DNA（RNA）在液体中杂交杂交漂洗除去未参与杂交的标记探针检测杂交信号制备待侧核酸样品分离、变性、转移、固化DNA片段预杂交制备核酸探针标记核
2、酸探针加入标记核酸探针图 18-1 核酸杂交程序示意图常用固相核酸杂交方法核酸分子杂交可分为3 个基本类型：鉴别DNA的分子杂交称为Southern印迹杂交（Southern blot ），待检的对象是DNA片段；鉴别RNA 的分子杂交称为Northern印迹杂交（Northern blot ），待检的对象是RNA片段；斑点杂交（Dot blot ）、原位杂交(In situ hybridization)、核酸酶保护分析法（Ribonuclease protection assay RPA ）等。Southern 印迹杂交1975年 ,英国爱丁堡大学的 E.M.Southern首创了这一方法。
3、为了纪念 E.M.Southern,将他建立的将 DNA片段从凝胶转移至滤膜的方法称为 Southern印迹转移。利用 Southern印迹杂交可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性、定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析（ RFLP）等。Southern 印迹杂交的基本步骤：1、基因组DNA的制备。2、适当的限制性核酸内切酶消化基因组 DNA。克隆片段，取0.10.5gDNA即可；鉴定单拷贝基因顺序 , DNA 1020g；探针比放射活性较低时 ,DNA 30 50g。3、琼脂糖凝胶电泳分离 DNA酶切片段。4、 Southern 印迹转移前的凝胶预处理。5、 Southe
4、rn 印迹转移。6、用标记的核酸探针与转移到固相支持物上的核酸片段进行杂交。7、杂交结果的显示。Northern印迹杂交Northern印迹杂交是指将RNA 变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上的过程，然后利用杂交反应来鉴定其中特定mRNA 分子的量与大小。对总RNA或 poly(A)+RNA中 mRNA进行定性或定量分析，即对基因进行表达分析。原位杂交（ In Situ hybridization）组织细胞的核酸分子原位杂交 (in situ nucleicacid molecular hybridization)是用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交, 从而对
5、组织细胞中的核酸进行定性、定位和 相对定量 分析。1969年 ,Pardue等首先用爪蟾核糖体基因探针进行细胞原位杂交 ,发现该基因位于核仁而建立原位杂交技术。1970年 ,Orth等最先用氚标记的兔乳头状瘤病毒 cDNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交, 检测病毒 DNA。1973年 ,Harrison等成功地用鼠 9S球蛋白DNA探针检测了鼠胎肝培养细胞中的球蛋白mRNA。70年代中后期, 开始采用原位杂交方法来筛选和鉴定重组DNA 克隆的菌落 (菌落原位杂交 )。80年代开始采用荧光原位杂交( Fluorescence in situ hybridization,FISH)等一些应
6、用较广泛的非放射性原位杂交方法。原位杂交1）同位素原位杂交 (Isotopic in situ hybridization)70年代2）非同位素原位杂交(Non-isotopic in situ hybridization)80年代中后期（ 1）免疫酶联（ 2）荧光原位杂交（ Fluorescence in situ hybridization, FISH)*同位素原位杂交的不足：1）不稳定；2）高背景；3）曝光时间长；4）结果统计学处理繁琐。5）同位素的使用和处理1.具有R 带带型的正常女性染色体，箭头示杂交颗粒集中分布于Xp1 1-c1lI 区2.杂交后 R显带的 46， Xdic(X)核
7、型，在迟复制的 X染色体上有 2处被杂交，为双着丝粒X 染色体（小箭头），正常 X染色体亦被杂交（大箭头）3.49,XXXXY个体标本的4个X染色体着丝校区均被杂交（箭头）4正常女性标本间期核内的杂交颗拉簇（箭头）5.49,XXXXY个体标本间期核杂交，各核分别显示1-4 个杂交颗粒簇（箭头）6.49,XXXXY个体标本间期核内的3个Bar 小体（箭头）7.用BrdU渗入方法制作的杂交后R带带型，箭头示2条X染色体着丝拉区被杂交图版来源荧光原位杂交Fluorescence in situ hybridization, FISH基本原理 :用标记了荧光的单链 DNA(探针 )和与其互补的 DNA
8、(玻片上的标本 )退火杂交 , 通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况FISH技术是常规染色体分析的辅助手段。它是用荧光素标记特异探针，与染色体做杂交后，根据特异的荧光信号来判断结果。它可用于标记染色体的识别、特异融合基因的检测、新基因定位，用全染色体涂抹探针识别复杂的染色体结构异常。间接标记用生物素或地高辛标记称为间接标记 , 杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号 , 因而 步骤较多, 操作麻烦, 其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大。直接标记直接用荧光素标记DNA 的方法称为直接标记。 由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号 , 省去了烦琐的免疫荧光反应 , 不需要购买荧光抗 体 , 也由于近年来荧光素亮度和抗淬灭性不断改进和提高 , 直接标记的荧光探针越来越成为首选 , 并采用多种不同颜色的荧光 , 方便在同一标本上同时检测多种异常。其荧光强度和信号大小都易于在普通荧光显微镜下观察 , 使 FISH过程变得简便而易于操作。
