1、MicroRNA与肿瘤,郭志云,中国癌症发病现状,我国近20年来癌症呈现年轻化及发病率和死亡率“三线”走高的趋势2012中国肿瘤登记年报报道，每分钟就有6人确诊为癌症,中国癌症发病现状,男性死亡率高于女性 数据来源于24个省的72个监测点，覆盖8500万人。年报显示，每年新发肿瘤病例约为312万例，平均每天8550人，全国每分钟有6人被诊断为癌症。 恶性肿瘤发病率全国35岁至39岁年龄段为87.07/10万，40岁至44岁年龄段几乎翻番，达到154.53/10万；50岁以上人群发病占全部发病的80%以上,中国癌症发病现状,肺癌居癌症死亡首位 从病种看，居全国恶性肿瘤发病第一位的是肺癌，其次为胃
2、癌、结直肠癌、肝癌和食管癌，前10位恶性肿瘤占全部恶性肿瘤的76.39%。 居全国恶性肿瘤死亡第一位的仍是肺癌，其次为肝癌、胃癌、食管癌和结直肠癌，前10位恶性肿瘤占全部恶性肿瘤的84.27%。死亡率最高者男女均为肺癌。,中国癌症发病现状,癌症呈地域分布明显 肺癌主要集中在东北、云南;食管癌高发区主要集中在河南、河北等中原地区；胃癌高发区主要集中在西北及沿海各省，如上海、江苏、甘肃、青海等较为突出；肝癌高发区集中在东南沿海及东北吉林等地区。,中国癌症村地图,BBC news report,China acknowledges cancer villages Chinas environment
3、 ministry appears to have acknowledged the existence of so-called “cancer villages“ after years of public speculation about the impact of pollution in certain areas. 22 February 2013,什么是肿瘤?,肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致克隆性异常增生而形成的新生物，常表现为局部肿块。根据肿瘤的生物学特性及其对机体危害性的不同，将肿瘤分为良性与恶性，后者常见的为癌与肉瘤
4、,肿瘤十大特征,肿瘤十大特征,自给自足的生长信号（Self-Sufficiency in Growth Signals） 抗生长信号的不敏感（Insensitivity to Antigrowth Signals） 抵抗细胞死亡(Resisting Cell Death) 潜力无限的复制能力(Limitless Replicative Potential) 持续的血管生成(Sustained Angiogenesis) 组织浸润和转移(Tissue Invasion and Metastasis) 避免免疫摧毁(Avoiding Immune Destruction) 促进肿瘤的炎症（Tumo
5、r Promotion Inflammation）细胞能量异常（Deregulating Cellular Energetics） 基因组不稳定和突变（Genome Instability and Mutation）,RNA的种类及主要功能,Ribosomal RNAs (rRNAs): translation Transfer RNAs (tRNAs): translation Messenger RNAs (mRNAs): protein template Noncoding RNAs(ncRNAs): various types and functions,Non-Coding RNA:
6、 Formerly known as “JUNK”,non-coding RNA(20-20000nt),RNA,mRNA,small non-coding RNA (miRNA)(20-500nt),long non-coding RNA (lncRNA)(500-20000nt),人类基因组草图带给科学家们的困惑,含有30亿对碱基的人类基因组仅含有23万个蛋白质基因，是果蝇的两倍，啤酒酵母的4倍。显而易见，生物的复杂性不由编码蛋白质的数目决定。 人类基因组的蛋白质编码区的总和占总基因组长度为12，那么其他98的基因组有什么功能呢？当然，在这98的非蛋白质编码基因组序列里，约24为插入编码序
7、列的内含子序列；人类基因平均每个基因有7个内含子。但这么冗长的内含子序列有什么生物学功能呢？,What is noncoding RNA?,Non-coding RNA (ncRNA) is a RNA molecule that functions without being translated into a proteinFrom Wikipedia, the free encyclopedia,microRNA,The discovery of miRNAs,miRNA was first discovered in 1993 by Victor Ambros at Harvard (
8、lin-4)The second miRNA Let-7 was discovered in 2000 by Frank Slack as a postdoc at Harvard (Ruvkun lab),Victor Ambros,Gary Ruvkun,18,2006年的诺贝尔生理学奖获得者：,Andrew Z. Fire Craig C. Mello,MicroRNA,MicroRNA是一种长度约为21nt的单链非编码小分子RNA 在进化过程中高度保守 其通过与靶基因序列的3UTR区特异性结合，诱导靶mRNA 降解或阻遏其翻译 MiRNA预计调控超过60%的蛋白编码基因并且参与近乎所有
9、已知的细胞进程,miRNA gene pri-miRNA (stem-loop structure) processed by Drosha pre-miRNA (6590 bp) carried by Exportin 5 to cytoplasm mature miRNA (2025 bp) is generated by the RNaseIII type enzyme Dicer directed by RISC to the miRNA target mRNA cleavage or impede its translation into protein,microRNA的合成,(1
10、) microRNA(miRNA)简写成miR，再根据其被克隆的先后顺序加上阿拉伯数字，如miR-21； (2) 高度同源的m i R N A 在数字后加上英文小写字母( a 、b 、c)，如miR-199a和miR-199b； (3) 由不同染色体上的DNA 序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA，则在后面加上阿拉伯数字以区分, 如miR-199a-1和miR-199a-2；,miRNA命名规则,(4) 如果一个前体的2个臂分别加工产生miRNA， 则根据克隆实验，在表达水平较低的 miRNA后面加“* ”，如miR-199a和miR-199a*，或进行如下命名，miR-142-5
11、p和miR-142-3p； (5) 将物种缩写置于miRNA之前，如hsa-miR-195；mmu-miR-195 (6) 确定命名规则之前发现的miRNA，如let-7，则保留原来名字。,Genomic Organization of miRNA Genes,Intronic miRNAs often in antisense direction, made from own promoterExonic miRNAs - non-coding (or in alternatively spliced exons),在细胞增殖、分化、代谢、凋亡与发育过程中发挥重要的调节作用。 例如: 1.
12、由lin-4和let-7编码的miRNA在线虫中控制了细胞分化和增殖的时序； 2. miR-430参与了斑马鱼的大脑发育； 3. miR-181控制哺乳动物血细胞分化为B细胞； 4. miR-375调节哺乳动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌； 5. miR-143在脂肪细胞分化起作用；,microRNA的生理功能,有些miRNA具有类似抑癌基因功能，通过转录后负性调控致瘤性靶基因的表达而发挥生物学功能；有些miRNA具有类似癌基因的作用，通过下调抑瘤性靶基因的表达而发挥功能。,恶性肿瘤的microRNA结构与表达异常,恶性肿瘤相关性microRNA,如果组织中某种或某些miRNA的表达失常，细胞内许
13、多起重要作用 的瘤基因或抑瘤基因就会受到异常调控而表达失常，从而导致肿瘤的发 生 。,原癌基因与抑癌基因,原癌基因（proto-oncogene ）癌基因(oncogene) Myc抑癌基因(cancer suppressor gene) p53,miR-21 （1）miR-21在乳腺癌、肝癌、脑瘤等多种恶性肿瘤中表达显著上 调，并与乳腺癌等肿瘤的恶性分级呈正相关； （2）miR-21 可能通过抑制其靶基因 TPM1(tropomyosin 1)的表达而促进胶质瘤细胞的增殖。 （3）miR-21通过负调控抑癌基因PTEN的表达，促进肝癌细胞的增殖和侵袭能力 。 （4）通过抑制PCD4 (pro
14、grammed cell death 4) mRNA的翻译效率，抑制MCF-7的增殖。,（一）致瘤性microRNA （onco-miRNA）,在microRNA (miRNA)家族中，有些miRNA具有类似癌基因功能，与肿瘤发生呈正相关，这部分miRNA称为致瘤性miRNA（onco-miRNA），其过表达或持续活化将直接导致肿瘤的发生发展。,let-7 家族 (1) Let-7是2000年由Reinhart等在线虫中发现的一种具有转录后调 节作用的miRNA，通过转录后调节lin-47和lin-51的表达而控制线虫向成虫的转变。 (2) Ras 是Let-7的直接靶基因，受到let-7家族
15、的负性调控。Ras是 一个膜相关的GTPase信号蛋白，具有调节细胞生长、分化的功能，是一个重要的瘤基因。 (3) 在肺癌、乳腺癌、子宫癌等恶性肿瘤中，let-7家族与这些肿瘤有关的脆性位点密切相关，在肺癌中其表达下调，是一个与肺癌预后负相关的抑癌基因。,（二）抑瘤性microRNA (suppressor miRNA),在miRNA 家族中，有些miRNA具有类似抑癌基因功能，与肿瘤发生呈负相关，称为抑癌性miRNA（suppressor miRNA）。抑癌性miRNA的表达下降或者缺失，将直接导致肿瘤的形成。,29,miRNA与肿瘤发生的关系存在两种可能的模式 Caldas, et al.
16、（Nature Medicine 2005） ： 1、若miRNA表达上调，其对应抑癌基因表达下调时，则可能导致肿瘤发生； 2、若miRNA表达下调，其对应癌基因表达上调时，同样可能导致肿瘤发生。,cancer-related miRNAs举例,四、恶性肿瘤microRNA的转录调控异常,（转录因子-microRNA-靶基因”交互作用的分子网一）“络,1转录因子对microRNA初级转录产物的调控,2. microRNA对靶基因的调控,大部分miRNA具有自己一套独立的顺式作用元件（启动子和增强子序列），受到上游一系列转录因子的调控。类似于蛋白编码基因的转录过程，这些转录因子通过与miRNA的
17、顺式作用元件结合，调节miRNA在转录水平的表达。,miRNAs与其靶基因3-UTR的结合位点并不是完全互补，可以存在短的错配和G-U配对，因此，miRNA调控多个靶基因。同时，同一个靶基因又同时受到多个miRNA的调控。 miR-21 TPM1、PCD4和PTEN ；miR-15，miR-16，miR-181和miR-195 bcl-2,因此，一个转录因子可以调控多个miRNA分子，一个miRNA分子又同时受到多个转录因子的调控；同时，一个miRNA分子能调控多个靶基因，而一个靶基因又同时受到多个miRNA分子的协同调控；它们之间组成了错综复杂的调控网络，实现了对人体生命活动以及疾病发生发展
18、和转归过程的精细调控。,3“转录因子-microRNA-靶基因”构成复杂的分子网络,microRNA与肿瘤的诊断和治疗,肿瘤的分子诊断与治疗是分子医学的重要组成部分，已成为当前肿瘤研究领域的热点。一些具有重要诊断和治疗价值的分子标志物已经在临床上得到了广泛的应用，但由于特异性、敏感性或靶向性等方面的因素，其临床应用仍然受到很大局限 。由于miRNA在肿瘤多阶段发生过程中具有独特的表达特征和生物学功能，miRNA在肿瘤的分子诊断和治疗中具有广泛应用前景。,恶性肿瘤增长的检测,肿瘤标记物 (无形的肿瘤),Tumor mass,1g,10,1mg,106,1g,109,10-100g,1010-11
19、,1kg,1012,临床可检测的肿瘤,肿瘤增长,Tumor cells,Lead time,一、microRNA与肿瘤的诊断,(一) 肿瘤组织特异性表达标志物,miRNA 表达特征来对肿瘤进行分类，并且筛选能对肿瘤进行预后评估的miRNA标记。,Lu等通过对多种组织来源肿瘤组织miRNA（约200个）表达谱进行归类，发现这些结果与肿瘤组织的胚胎来源一致。例如，内皮起源肿瘤，如直肠癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等被分成一类，血液系统来源的也被归为一类。而16000个蛋白编码基因的mRNA则不能将其聚在同一类。因此，肿瘤的miRNA表达特征反映了其发育起源，这也与miRNAs 指导组织特异性发育功能相一致
20、。,1. 肿瘤的miRNA表达特征反映了其发育起源,许多的研究通过miRNA芯片技术系统研究了miRNA在胃癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、白血病等肿瘤组织与其正常组织中的差异表达，构建了相应肿瘤组织与正常组织差异miRNA表达谱，筛选出了一些具有临床诊断价值的分子靶标。 如，miR-221、miR-301和miR-376a诊断胰腺癌。,(2) miRNA指导临床肿瘤诊断,（3）miRNA非常稳定,福尔马林固定的石蜡包埋的样品中分离出来，这使得miRNA表达谱特征库的建立成为可能。,(二) 肿瘤血清标志物,血清的获得相对比较简单、对病人创伤少，因此肿瘤血清标志物越来越受到广大医学研究
21、者青睐。,（1）miRNA在血浆和血清中非常稳定，它们被有效保护以避免接触RNases，在严酷的环境条件下仍能保持稳定。（2）miRNA在血浆和血清中稳定性使得其实际值与在病人身上得到的测试值非常吻合。,第一个被发现的血清miRNA标志物是miR-21。Lawrie等人证实，弥漫性大B细胞淋巴瘤病人的血清miR-21水平很高，与淋巴瘤存活率呈负相关，是一个淋巴瘤预后预测的理想分子靶标。,血清miRNA与肿瘤,Cell research, 2008,二、microRNA与肿瘤治疗,（1）microRNA (miRNA)具有重要的生物学功能，参与肿瘤的发生发展； （2）miRNA序列短，操控简单，
22、基因药物容易导入到宿主体内，从而逆转肿瘤的恶性生物学行为，达到治疗肿瘤的目的。 （3）根据miRNA的生物学功能，可以从癌基因和抑癌基因的角度设计针对性药物对肿瘤进行治疗。,针对致瘤性miRNA设计药物：人工合成的反义寡聚核苷酸-抗miRNA寡聚核苷酸（AMOs）在灭活具有癌基因特性的miRNA表达，逆转肿瘤细胞恶性生物学行为等方面取得了很大的突破。动物实验结果表明，与胆固醇偶联的AMOs注射小鼠后，可以在小鼠的不同器官有效抑 制靶miRNA活性，抑制肿瘤的生长和恶性生物学行为。 针对抑瘤性miRNA设计药物：利用病毒或者脂质体可以瞬时引入大量具有抑瘤基因的miRNA （如let-7 家族）
23、。这些技术可以保证在某些组织特异性的启动子控制之下，表达pre-miRNA 及其两侧序列，并且刺激内源性的miRNA加工，产生正确的miRNA，抑制特定基因表达。,生物公司针对 miR-21治疗肺癌。,A case study,Therapeutic microRNA Delivery Suppresses Tumorigenesis in a Murine Liver Cancer ModelCell 137, 10051017, June 12, 2009,(一) miRNA基因的克隆和鉴定,1直接克隆法,该方法通过建立富集miRNA的cDNA文库，进行测序及序列分析，排除已知序列后，剩下
24、的新序列去检索基因组数据库，并用mFold软件分析其是否有发夹结构的前体。最后通过Northern印迹对其进行鉴定。,microRNA研究方法,miR-124a is restricted to the brain and spinal cord in fish and mouse or to the ventral nerve cord in flymiR-1 is restricted to the muscles and the heart in mouse,2建立在突变表型基础之上的正向遗传学筛选,正向遗传学遵循的是从突变体表型分析到基因功能认识的思维方式，它首先关注的是具有某种缺陷的
25、突变体。在得到了这样的一个突变体之后，可以对其中的突变基因进行定位和克隆。缺点： 筛选miRNA效率低； miRNA 单个缺失或突变只带来微小的表型差异甚至没有表型差异造成许多miRNA被遗漏。,案例： 果蝇中的bantam、miR-14、miR-278和线虫中的lsy-6均是通过这种方法鉴定出来的。,3生物信息学分析,miRNA是从具有发夹结构的前体加工而来，而且有些miRNA序列或其前体序列在进化上比较保守。这些特点构成了生物信息学筛选miRNA基因的基础。根据某些miRNA基因保守结构的特点为基础设计计算机程序，扫描基因组序列以鉴定潜在的miRNA基因。,优点： 提高了miRNA鉴定的速
26、度和效率； 预计不同物种中miRNA种类的总数 ； 需要通过实验验证。,（二）miRNA表达规律的研究,1. miRNA芯片技术,将目前已经克隆的miRNA或潜在miRNA制备成探针固定在尼龙膜或其它固相支持物上，然后与不同组别的总RNA或细胞器RNA杂交，通过信号的强弱比较探讨miRNA 的表达状况。 该方法类似于基因芯片技术，具有高通量、快速等优点，是目前疾病相关miRNA筛选常用的一种技术。,qRT-PCR Northern Blot 原位杂交技术等 RNA-seq,52,miRNA芯片是目前筛选和研究miRNA调控的高通量手段,RNA-seq 是另一种高通量研究方法,RNA-Seq:
27、a revolutionary tool for Transcriptomics，Nature,2009,10:57,miRBase http:/www.mirbase.org/,miRViewerhttp:/people.csail.mit.edu/akiezun/miRviewer,References,Role of miRNAs in Cancer and Apoptosis Lynan-Lennon Biol Rev Camb Philos Soc. 2009 Feb;84(1):55-71 Causes and consequences of microRNA dysregulat
28、ion in cancer Croce Nat Rev Genet. 2009 Oct;10(10):704-14. miRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Zhang Dev Biol. 2007 Feb 1;302(1):1-1 Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Lee Science. 2002 Oct 25;298(5594):799-804. RNA regulation: a new genetics? Mattick Nat Rev Gen
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