1、第七章化学人工酶和酶的非水相催化,第一节 化学人工酶,人工酶(Artificial Enzyme)：根据酶的催化原理，模拟酶的生物催化功能，用有机化学和生物学的方法合成具有专一催化功能的酶的模拟物。 包括半合成酶和全合成酶。 底物结合位点 催化位点 疏水微环境,模拟酶的酶学基础酶的作用机制：过渡态理论对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究,一、半合成酶,半合成酶 将具有一定结构和功能的物质与特异的蛋白质结合，便可形成新的生物催化剂半合成酶。,一、半合成酶,1将具有催化活性的金属或金属有机物与具有特异性的蛋白质相结合，形成半合成酶。 Gray与Margalit将电子传递催化剂Rn(NH3)53
2、+，与巨头鲸肌红蛋白结合，产生半合成的无机生物酶。肌红蛋白传递氧气， Rn(NH3)53+能氧化各种有机物(如抗坏血酸)。这种人工酶的催化效率是钙一咪唑复合物的200倍，接近天然的抗坏血酸氧化酶的活力。,2将具有特异性的物质与具有催化活力的酶相结合，形成半合成酶。 美国Schultz小组，寡聚核苷酸链连接到RNA酶的Cys166上。利用寡聚核苷酸链的碱基互补关系，显示出对RNA链特定位点的水解作用。第一个不同于DNA限制性内切酶的RNA限制性内切酶。 Kaiser小组 黄素木瓜蛋白酶(FP) 木瓜蛋白酶Cys25的巯基参与蛋白质水解反应,而黄素是一组含N的三环芳香化合物，能催化许多不同的化学反
3、应。8溴乙酰黄素与此巯基结合后，丧失水解活性，FP催化效率是黄素的 1000倍，达到了天然黄素氧化还原酶的活性。,二、全合成酶,全合成酶（不是蛋白质，而是有机化合物） 通过将催化基团并入有机化合物，控制空间构象，选择性地催化化学反应。全合成酶包括小分子有机物(大多为金属络合物)、抗体酶(催化抗体)、人工聚合物酶。,二、全合成酶,1、小分子有机物全合成酶：利用各种有机分子(如-环糊精、卟啉等)和金属离子而制备的具有水解、氧化还原、转氨、羟醛缩合酶等功能的全合成酶：(1)氨肽酶全合成酶：三乙撑四胺(Trien)的Co 络合物。(2)转氨全合成酶：Gly与Ala的西佛氏碱的Cu()络合物。(3)AT
4、P水解全合成酶：CoEdda(H2O2)2-等。 -Benzyme人工酶能模拟-胰凝乳蛋白酶活性由环糊精制成的人工转氨酶能催化酮酸与磷酸吡哆胺专一性地合成氨基酸。,环糊精结构示意,CD分子原来：在CD的两面引入催化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，改善CD的疏水结合和催化功能现在，桥联环糊精和聚合环糊精，可得到双重或多重疏水结合作用和多重识别作用,a-胰凝乳蛋白酶模型简介,环糊精和催化侧链组成全合成酶：催化侧链含有天然酶三种基团（羟基、咪唑基及羧基），且在恰当的位置。 是非蛋白质分子，比天然酶稳定,二胺、多胺环糊精模拟醛缩酶功能，催化丙酮与对硝基苯甲醛缩合。,桥联环糊精催化羧酸对硝基苯酯的
5、水解,2、抗体酶（Abzyme)：以抗原或半抗原（过渡态类似物）制备的，并能催化其反应的抗体。,3、人工聚合物酶 ：用分子印迹技术制备的人工酶。其原理与抗体酶相同，只是用人工聚合物代替抗体。 以对硝基酚甲基磷酸酯（硝基酚乙酸酯水解反应的过渡态类似物）为模板，得到的有机功能团的聚合物，可以催化硝基酚乙酸酯水解。,4.肽酶： 模拟天然酶活性中心，用人工方法合成具有催化活性的多肽。 1977年人工合成一个八肽具有溶菌酶的活性。,三、设计要点,设计前：酶活性中心-底物复合物的结构酶的专一性及其同底物结合方式的能力反应的动力学及各中间物的知识,三、设计要点,设计中：为底物提供良好的微环境（疏水性）应提供
6、形成离子键、氢键的可能性，以利于结合底物催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性,1984年A. Zaks 和A.M Klibanov 首次发表了关于非水相介质中脂肪酶的催化行为及热稳定性的研究报道，引起了广泛的关注。传统的酶学领域迅速产生一个全新的分支非水酶学。 现在非水酶学方法在多肽合成、聚合物合成、药物合成以及立体异构体拆分等方面显示出广阔的应用前景。,第二节 非水介质中的酶催化反应,非水相介质：有机溶剂反应介质，气相反应介质，超临界流体反应介质。优点：1)酶在有机介质中由于水分子的减少，相对来说酶分子的构象表现出比水溶液中更
7、具有“刚性”特点。因而使通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些特性成为可能。例如在有机溶剂中，可以利用酶与配体的相互作用性质，诱导改变酶分子的构象，调控酶的底物专一性,、立体选择性和手性选择性等。,(3) 由于引起酶变性的许多因素都与水的存在有关, 因此在有机介质中酶的稳定性得到显著提高。,(2) 在适当的条件下，可以改变酶促反应的热力学平衡向有利于合成方向（而不是水解方向）进行。,(5) 在有机介质中进行的酶促反应，可以省略产物的萃取分离过程, 提高收率，从低沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易；酶不溶于有机介质，易于回收再利用。,(4) 由于有机溶剂的存在, 水量减少，大大降低了许多需要水参与
8、的副反应，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移等。,(6) 脂溶性底物和产物在有机溶剂中的高度溶解性, 有利于提高底物浓度总的水平。同时由于底物和产物的高脂溶性，使它们在酶分子表面的实际浓度较低, 可以减少底物或产物对酶引起的抑制作用。(7)在有机溶剂的存在下，一般不存在微生物污染问题。(8) 由于酶不溶于有机溶剂中，所以是一个非均相反应体系。应用振荡或搅拌改善底物及产物的交换是反应的关键。,一、有机相酶反应具备条件,1 保证必需水含量。2 选择合适的酶及酶形式。3 选择合适的溶剂及反应体系。4 选择最佳pH值。,二、水的作用,(一)必需水与低水系统含水量与酶稳定性有关，温度升高导致酶分子发生
9、可逆折叠，然后进行一种或几种下列反应： (1)形成不规则结构。 (2)通过消除使SS键破坏。 (3)Asn和Gln脱酰胺。 (4)Asn残基水解。酶在无水环境中不发生上述反应，表现异常稳定。,必需水(Essential Water)：维持酶催化活性所必须的最少量的水。与酶分子紧密结合的一层左右的水分子，对酶活性至关重要的。不同酶与必需水结合的紧密程度及所结合的必需水量是不同的。 把有机溶剂中酶催化反应理解为宏观上是非水相，而微观上是微水相反应。因此非水体系又称低水体系。,(二)必需水量对酶活性的影响,1983年，Rupley等人从溶菌酶的结论得知，一个干燥蛋白的水合过程经过4个步骤： (1)加
10、入的水首先与酶分子表面的带电基团结合，达到每克蛋白质00.07g水。 (2)然后与酶分子表面的极性基团结合(每克蛋白质0.070.25g水)。 (3)多出来的水再凝聚到蛋白质分子表而相互作用较弱的部位(每克蛋白质0.250.38g水)。 (4)最后，酶分子表面完全水化，被一层水分子所覆盖(每克蛋白质0.38g水，大约300个水分子)。,脂肪酶活性与水的关系,在反应体系中，必需水量也决定于有机溶剂。,二、有机溶剂的选择,1、有机溶剂与酶活性： 溶剂主要是通过对体系中水、酶以及底物和产物的作用来间接地或直接地影响酶活性：(1)对吸附在酶分子上的水分的影响，溶剂可以夺走吸附在酶分子表面的必需水，破坏
11、了维持酶蛋白构象的氢键和疏水作用，降低了酶的活性和稳定性。,(2)对底物和产物的影响，有机溶剂可以直接与底物、产物分子发生反应，或者可以通过底物和产物在水相和有机相的分配，从而影响其在酶分子表面的水层中的浓度来改变酶的活性。 (3)对酶的直接影响，溶解于水层中的溶剂分子可以抑制处于水中的酶或使酶失活，酶与两相界面的直接接触也可导致酶的失活,2选择有机溶剂必须考虑因素,(1)有机溶剂与反应的匹配性（即相容性） 包括反应产物与溶剂的匹配性，极性产物倾向于保留在酶附近，可能引起产物抑制或不必要的副反应发生。,相容性,例：对于酶促糖改性而言，使用疏水性的，与水不互溶的溶剂是不现实的，因为不溶性底物和不
12、溶性的酶之间无相互作用，必须用亲水性的溶剂（如吡啶或二甲基甲酰胺）,(2)溶剂必须对于该主反应是惰性,例：酯基转移反应涉及到醇对于酯的亲核攻击而产生另一种酯，如果溶剂也是酯，就会生成以溶剂为基础的酯，如果溶剂是醇，也会得到类似结果。,(3)必须考虑的其他因素,溶剂的密度、黏度、表面张力、毒性、废物处理和成本等（溶剂因底物而宜）溶剂参数lgP：即一种溶剂在辛醇/水两相间分配系数的常用对数值，它能直接反映溶剂的疏水性。,五、酶在微水体系中的催化特点,1、酶分子在有机溶剂中的结构特点酶蛋白分子内氢键起主导作用，导致蛋白质结构刚性，酶的稳定性提高。,2、酶的作用pH与离子强度有机溶剂中酶活性与酶干燥前
13、或吸附于载体前所在的缓冲液pH和离子强度相关。酶能“记忆”原缓冲液的pH，保持在原缓冲液中的构象。,3、酶的底物专一性,溶剂性质对酶的立体专一性的影响：在疏水性差的溶剂中，萘甲酰基进入酶的疏水性袋中比暴露在溶剂中热力学平衡更为有利。,在疏水性强的溶剂中，萘甲酰基暴露在疏水性溶剂中，而不易进入酶的疏水性袋中。,4、盐类及其他极性添加物对酶活性的影响在有机溶剂中，盐能增加酶的催化活性。低logP值和高介电常数的极性化合物，增加酶的活性。酶在冻干前适当加入多元醇，可提高酶的活性。,六 、有机介质对酶性质的影响,1、稳定性2、活性3、专一性4、反应平衡方向,（一）稳定性,（）热稳定性提高（）储存稳定性
14、提高,结论,在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。,（二）活性,1、单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响（1） 有机溶剂直接作用于酶（2） 有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度（最适浓度）达到最大值；若浓度再升高，则活性下降。,2、低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保存，但也有某些酶活性亦变化,例：有人对吸附在不同载体上的胰凝乳蛋白酶或乙酸脱氢酶在各种水浓度下的酶活性研究表明，酶活性随水活度大小而变化，在一定水活度下，酶活性随载体不同而变化,3、在反向微团体系中，微
15、团效应使某些酶活性增加,超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性（Super-activity）。认为：超活性是由围绕在酶分子外面的表面活性剂这一外壳之较大刚性所引起。,（三）专一性,某一些有机介质可能使某些酶的专一性发生变化，这是酶活性中心构象刚性增强的结果。有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主导反应。,在手性药物酮基布洛芬的酶促拆分研究中， “微环境调控”方法，将一选择性很低的商品脂肪酶(Lipase OF)改造为高度立体专一性的生物催化剂，应用于酮基布洛芬的对映体拆分。表明, 酶的选择性并不完全由其基因序列或蛋白质的一级结构所决定，还受到所处环境条件对其高级构象
16、的调控作用。这为化学工程师通过介质工程(微环境工程)或构象工程(而非蛋白质工程)的手法，在不改变酶之基本结构的前提下强化酶的催化功能提供了科学依据，也为拓展已知酶对非天然底物或在非生理条件下的应用范围奠定了科学基础。,（四）反应平衡方向,七、酶形式的选择,（1）酶粉： 例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发现催化活性随反应体系中酶量的减少而显著增加。,（） 化学修饰酶（疏水性修饰、反相胶束）： 例如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、PH、蛋白酶水解的稳定性均高于天然SOD。,（） 固定化酶： 把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有机介质变
17、性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高。,（） 固定化酶：,有机相中固定化后载体对酶的影响,A.载体能通过分配效应剧烈地改变酶微环境中底物和产物的局部浓度。,B.载体影响酶分子上的结合水,通过选择合适的载体可使体系中的水进行有利分配。,C.通过载体与酶之间形成的多点结合作用，可稳定酶的催化活性构象。,例：-胰凝乳蛋白酶与聚丙烯酰胺凝胶共价结合后，在乙醇中的稳定性明显提高，并且对有机溶剂的抗性随酶与载体间共价键数量的增加而增强。,D.酶动力学影响一个酶同时催化的两个反应的相对速度。,例 在低水活度下把胰凝乳蛋白酶固定在聚酰胺载体上，水解反应被抑制却有利于醇解反应。,八、酶在微水体系中的应用,1、
18、有机合成氧化光学活性物质的合成手性药物的合成油和脂肪的精制（生物柴油）生物表面活性剂的合成肽的合成其他的专一性合成,2、化学分析（胆固醇的测定）3、聚合（高聚物合成，环保材料合成）4、解聚5、外消旋混合物的分离,酶促反应从单一水相拓展到各种非水溶剂体系，为酶在非生理条件下的应用开辟了广阔的空间。 华东理工大学构建的非水相酶反应器及其长期稳定运行案例，充分显示了生物催化剂在工业化学品合成方面的显著优势和巨大应用潜力。例如，非水相酶促逆水解法合成糖苷的方法和结果。另外利用自行筛选研制的沙雷氏菌脂肪酶成功地在甲苯-水两相体系中实现了心血管药物地尔硫卓手性前体()-环氧酯的高度对映选择性水解, 产品的
19、光学纯度高达99%以上，而且大大缩短了反应工艺路线，是一项典型的绿色化学工艺。,合成药物过程中手性的重要性,药物、除草剂和杀虫剂常通过和受体、酶、大分子载体等相互作用而发挥其功效。所有这类相互作用是高度立体专一性的。 抗痨药物乙胺丁醇2,2-(乙烯二亚氨基)-二-1-丁醇二盐酸盐的右旋异构体，具有有效的抗痨活性，然而左旋异构体使视神经变性，导致失明。普洛帕吩-(+)-4-(二甲基氨基)-3-甲基-1,2-二苯基-2-丁醇丙酸酯的右旋异构体是一种止痛药，然而左旋异构体是一种咳嗽抑制剂。,脂肪酸酯的合成,酶催化的酯交换反应和酯合成反应也成功的应用到需要量小、价值高的食品、医药产品、化妆品添加剂的合成中。其中包括简单的烷基、萜烯、硫醇酯以及蜡酯，如异戊酸乙酯、油酸戊醇酯，乙酸牻牛耳春牛儿醇酯、乙酸香茅醇酯，棕榈酸异丙醇酯等。,多肽的合成,例a-胰蛋白酶可以催化N- 乙酰色氨酸与亮氨酸合成二肽水中反应合成率为0.1%以下在乙酸乙酯和微量水组成的系统中，合成率可达100%,甾体转化,例可的松转化为氢化可的松的酶促反应，在水-乙酸丁酯或水-乙酸乙酯组成的系统中，转化率高达100%和90%,
