1、基因组编辑技术 -CRISPR/Cas9 杨兴林 博士 主要内容 1. CRISPR/Cas9技术的基本原理 2. CRISPR/Cas9主要实验流程 3. 和元公司 CRISPR/Cas9系统介绍 CRISPR/Cas9技术的基本原理 一种利用同源重组 (Homologous Recombination,HR) 或者非同源末端连接 (Non-homologous End Joining, NHEJ) 原理改变生物体内源基因 的遗传学技术。 这一技术可以用于删除某一基因 、 去除外显子或导入点突变 ， 从而可以对此基因的功能进行研究 。 基因组编辑技术 HR&NHEJ 靶向基因操作技术的发展
2、同源重组载体 几率低 (1 HR event per 105 - 106 cells） 主要应用在动物水平 很难进行细胞水平的基因操作 同源重组载体 DSB(double-strand breaks)的引入 同源同组效率提高 1-2个数量级（ 10-100倍） 引入 靶向的双链断裂 (DSB) 蛋白 /复合体要 满足的基本条件： 1. 能入核 2. 能识别指定的 DNA序列并与之结合 3. 具有非序列特异的核酸 酶活性 归巢核酸内切酶 (meganucleases) 每个 DNA结合域单位识别 12-40个连续的碱 基 锌指核酸酶 (zinc finger nucleases, ZFNs) 6
3、aa可特异识别 3连碱 基 TALEN (Transcription activator-like effector nuclease) CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated proteins) CRISPR/CAS9系统 Cas9系统原理示意图 GN19NGG CRISPR/CAS9系统目前的问题 三种基因组编辑技术设计方案的比较 二聚体活性 延续 ZFN设计思路 mutant Cas9 CRISPR/Cas9主要实验流程 靶基因分析 - 第一外显子 - 第一内含子
4、 - 第二外显子 Cas9位点查找 选择最优的 cas9靶点 Cas9位点查找 Cas9载体构建 Cel1实验原理示意图 Cas9载体活性验证 Cas9质粒 活性检测实例 PCR产物 500bp 预测切割产物 340bp 预测切割产物 160bp Control Cas9 和元公司 CRISPR/Cas9系统介绍 基于慢病毒载体的 Cas9系统 基于腺病毒载体的 Cas9系统 基于腺相关病毒载体的 Cas9系统 和元 Cas9载体系统 几种常见病毒系统比较 载体 大小 载体全名 编号 说明 9.0kb pAdeno-U6-sgRNA-CMV-3Flag-hCas9 H210 单一载体含 gRNA和 Cas9 9.0kb pAdeno-U6-sgRNA-CMV-3Flag-hCas9n H214 单一载体含 gRNA和 Cas9n 5.5kb pAdeno-U6-gRNA-CMV-EGFP H217 腺病毒 ,gRNA载体 9.1kb pAdeno-CMV-mCherry-T2A-3Flag-hCas9 H218 腺病毒 , 红色荧光标记 9.1kb pAdeno-CMV-mCherry-T2A-3Flag-hCas9n H219 腺病毒 ,Cas9n红色荧光标记 基于腺病毒载体的 Cas9系统
