1、第一章 氨基酸,蛋白质的基本结构单位,一 蛋白质的水解,根据水解程度 完全水解：彻底水解-得到的水解产物是各种AA的混合物。 部分水解（不完全水解）-得到的产物是各种大小不等的肽段和AA。,三种水解方法：酸，碱，酶,1酸水解： 用硫酸（4mol/L）或HCL（6mol/L）水解 条件：回流煮沸20h，完全水解 优点：不引起消旋作用，得到L-AA 缺点：色AA完全被沸酸所破坏 羟基AA（丝AA及苏AA）有一小部分被分解 天冬酰胺和谷胺酰胺的酰胺基被水解下来,2碱水解：,NaOH(5mol/L) 条件：与NaOH共煮10-20h,完全水解 优点：色AA是稳定的 缺点：产生消旋现象，所得产物是D型和
2、L型AA的混合物（称消旋物）。碱水解引起精AA脱氨，生成鸟AA和尿素。,3酶水解,胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶 优点：不产生消旋作用，也不破坏AA 缺点：一种酶往往水解不彻底，需要几种酶协同作用才能使蛋白质完全水解所需时间较长，部分水解 适用范围：用于蛋白质一级结构分析以获得蛋白质的部分水解产物。,二AA的分类,参与蛋白质组成的常见AA只有20种 蛋白质AA- 20种AA 非蛋白质AA-180多种天然AA大多数是不参与蛋白质组成的。这些AA被称为非蛋白质AA。,(一)常见的蛋白质AA20种,共同点：与羧基相邻的-碳原子上都有一个NH2，因而称为-AA。 通式：,1 性质（-AA）, -碳原子是
3、一个不对称碳原子（甘AA除外）或手性中心。-AA具有旋光性。 晶体（白色），熔点很高，一般在200度以上。 每种AA都有特殊的结晶形状，可用以鉴别各种AA； 一般都溶于水（除胱AA和酪AA）脯AA和羟脯AA还能溶于乙醇或乙醚中； 为表达蛋白质或多肽结构的需要。AA的名称常使用三字母的简写符号表达，也使用单字母的简写符号表示-主要用于表达长多肽链的AA顺序。,2.分类：,主要区别在侧链R基的不同,B 按R基的极性性质,Non-polar Amino Acids,There are 8 non-polar amino acids:,性质：,在水中的溶解度比极性R基AA小； 丙AA的R基疏水性为最小
4、； 它介于非极性R基AA和不带电荷的极性R基AA之间。,不带电荷的极性R基AA,Polar, Uncharged Amino Acids,There 7 polar, uncharged amino acids:,特点：,比非极性R基AA易溶于水，含有不离解的极性基，能与水形成氢键 半胱AA,酪AA-R基极性最强。,Polar, Charged Amino Acids,There are 5 polar charged amino acids:,个性氨基酸,Notes on Histidine,Contains an imidazole(咪唑） ring that is partially p
5、rotonated （质子化）in neutral solution Only the pyridine-like（似吡啶）, doubly bonded nitrogen in histidine（组氨酸） is basic. The pyrrole-like（似吡咯） singly bonded nitrogen is nonbasic because its lone pair of electrons is part of the 6 electron aromatic imidazole ring,Types of side chains,Neutral: Fifteen of th
6、e twenty have neutral side chains（中性侧链） Asp（天冬） and Glu （谷）have a second COOH and are acidic（酸性的） Lys（赖）, Arg（精）, His（组） have additional basic amino groups side chains (the N in tryptophan（色） is a very weak base) Cys（半胱）, Ser（丝）, Tyr（ 酪） (OH and SH) are weak acids （微酸）that are good nucleophiles（亲核物）
7、,Abbreviations and Codes,Alanine（丙） A, Ala Arginine（精） R, Arg Asparagine（天冬酰） N, Asn Aspartic acid（天冬）D, Asp Cysteine（半胱） C, Cys Glutamine（谷氨酰） Q, Gln Glutamic Acid（谷） E, Glu Glycine（甘） G, Gly Histidine（组） H, His Isoleucine（异亮） I, Ile,Leucine（亮） L, Leu Lysine （赖）K, Lys Methionine（蛋/甲硫） M, Met Phenyl
8、alanine（苯丙）F, Phe Proline（脯） P, Pro Serine（丝） S, Ser Threonine（苏） T, Thr Tryptophan（色） W, Trp Tyrosine（酪）Y, Tyr Valine（缬） V, Val,Learning the Names and Codes,The names are not systematic so you learn them by using them (They become your friends) One letter codes learn them too If only one amino acid
9、 begins with that letter, use it (Cys, His, Ile, Met, Ser, Val) If more than one begins with that letter, the more common one uses the letter (Ala, Gly, Leu, Pro, Thr) For the others, some are phonetic（发音的）: Fenylalanine（苯丙）, aRginine（精）, tYrosine（酪） Trp（色） has a double ring, hence W Amides（酰胺） have
10、 letters from the middle of the alphabet (Q Think of “Qtamine” for glutamine; asparagine -contains N “Acid” ends in D and E follows (smallest is first: aspartic aciD, Glutamic acid E),（二）不常见的蛋白质AA,由常见AA衍生而来的,N-甲基赖氨酸（N-methyllysine）存在于肌球蛋白，一种行使收缩功能的肌肉蛋白质。另一个重要的特有氨基酸是-羧基谷氨酸（-carboxyglutamic acid）。,首先在
11、凝身酶原（prothrombin）中发现，它也存在于某些具有结合Ca2+离子功能的其他蛋白质。一个结构复杂的特有氨基酸叫做锁链素（desmosine）， 它是赖氨酸的衍生物，中央的吡啶环结构是由4个赖氨酸分子的侧链组成的。此氨基酸只存在于弹性蛋白（elastin）中。,此外，从甲状腺蛋白中分离出3,5二碘酪氨酸（3,5-diiodotyrosine）和甲状腺素（thyroxine）等，它们都是酪氨酸的衍生物，结构式见“激素“章。,（三）非蛋白质AA,180种其他AA 这些AA大多是蛋白质中存在的那些L型AA的衍生物，也有些是 AA,有些是，-AA，有些是D-型AA,Essential Amin
12、o Acids,All 20 of the amino acids are necessary for protein synthesis Humans can synthesize only 10 of the 20 The other 10 must be obtained from food8种：一（异亮）家（甲硫）写（缬）两（亮）三（色）本（苯）书（苏）来（赖）； 2种半必需：精和组，对幼儿合成速度不能满足需要，但成年后可满足。,三、氨基酸的旋光性和光吸收,1D，L之分 2“之分 1, 2都与糖相同 3-AA具有旋光性 消旋物-旋光性物质在化学反应中，只要其不对称原子经过对称状态的中间
13、阶段，即将发生消旋作用，并转变为D型和L型的等摩尔混合物，称消旋物。 蛋白质+碱 共热 水解 有机合成方法合成AA 得到的AA无旋光性的DL-消旋物,AA有D，L型之分：与甘油醛比较而确定的,例如丙氨酸的两种旋光异构体不同表现方式如下：,L型氨基酸是自然界存在的主要形式，且仅L型异构体参与任一个代谢反应（例外甚少）。,苏AA的四个异构体 P143,其中，D-苏AA与L-别-苏AA不存在互成物体与镜像的关系，这种不互成物体与镜象关系的光学异构体，称为非对映体。,胱AA有两个不对称中心，是相同的,a 两个不对称中心的构型可以是相同的。产生D，L型两个异构体。 b 两个不对称中心的构型可以是不相同的
14、，一个不对称中心的构型将是另一个不对称中心的构型的镜象。分子内互相抵消而无旋光性。这种胱AA异构体称为内消旋胱AA 。,氨基酸的光吸收性,20种氨基酸在可见光区域无光吸收，在远紫外区（220nm均有光吸收，在近紫外区（220-300nm）只有Tyr、Phe、Trp有吸收。 Tyr、Phe、Trp的R基含有共轭双键，在220-300nm紫外区有吸收。,（nm） Tyr 275 1.4103 Phe 257 2.0102 Trp 280 5.6103,四 氨基酸的酸碱性质（重点）,1、 氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在 -氨基酸都含有-COOH和-NH2，都是不挥发的结晶固体，熔点20
15、0-350，不溶于非极性溶剂，而易溶于水，这些性质与典型的羧酸（R-COOH）或胺（R-NH2）明显不同。,三个现象：,晶体熔点高离子晶格，不是分子晶格。 不溶于非极性溶剂极性分子 介电常数高（氨基酸使水的介电常数增高，而乙醇、丙酮使水的介电常数降低。）水溶液中的氨基酸是极性分子。,原因：,-羧基pK1在2.0左右，当pH3.5，-羧基以-COO-形式存在。-氨基pK2在9.4左右，当pH8.0时，-氨基以-NH+3形式存在。在pH3.5-8.0时，带有相反电荷，因此氨基酸在水溶液中是以两性离子离子形式存在。 Gly溶点232比相应的乙酸（16.5）、乙胺（-80.5）高，可推测氨基酸在晶体状
16、态也是以两性离子形式存在。,Structures of Amino Acids,In neutral solution, the COOH is ionized（解离） and the NH2 is protonated（质子化） The resulting structures have “+” and “-” charges (a dipolar ion, or zwitterion（两性离子）) They are like ionic salts in solution,氨基酸的两性性质,2 氨基酸的两性解离和酸碱滴定曲线,Pk2是AA的NH3+被滴定一半时的pH （ NH3+释放H+）
17、,Pk1是AA的coo- 被滴定一半时的pH （coo-结合H+）,氨基酸的等电点等电点（pI）,当溶液处于某一特定pH时，氨基酸主要 以两性离子存在，其净电荷为零，在电场中既 不向正极也不向负极移动，这时溶液的pH值 叫该氨基酸的等电点，用pI表示。对氨基酸而言，等电点就是它的等离点， 即正负离子相等时的pH值。,pI Depends on Side Chain,The 15 amino acids thiol, hydroxyl groups or pure hydrocarbon side chains have pI = 5.0 to 6.5 (average of the pKas)
18、 D and E have acidic side chains and a lower pI H, R, K have basic side chains and higher pI,氨基酸等电点（pI）的计算,中性氨基酸：pI=1/2（pk1+pK2) 酸性氨基酸： pI=1/2（pk1+pKR) 碱性氨基酸： pI=1/2（pk2+pKR),五、氨基酸的化学反应,1、与茚三酮反应茚三酮在弱酸中与-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质。（max=570nm）定性、定量。,2、与DNFP（ 2.4一二硝基氟苯）反应：,Sanger
19、反应二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），黄色，层析法鉴定，被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸。,3、与苯异硫氰酸酯反应：,PTH-氨基酸，无色，可以用层析法分离鉴定。被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸。,4、生成肽键：,5、与苄氧羰基氯反应,（1）茚三酮反应AA +水合茚三酮 蓝紫色化合物 （2）Sanger反应AA +DNFB DNP氨基酸（黄色） （3）Dansyl-cl反应AA+DNS-Cl DNP氨基酸（荧光） （4）Edman反应AA + PITC PTC-AA PTH-AA + H2O,加热,NaHCO3 pH8-9、室温,pH9.7,pH8.3,无水HF,六、氨
20、基酸的分离和分析,1、 电泳分离 电泳的基本原理 举例：Glu、Leu 、His 、Lys，4种混合样，在pH6.0时，泳动方向及相对速度。 Glu Leu His Lys pI 3.22 5.98 7.59 9.74,2、 滤纸层析和薄层层析,分配原理,层析法色层分析法（吸附层析法）系统的组成 固定相（静相）流动相（动相）分配系数描述混合物的在这两相中的分配情况分配定律当一种溶质在两种一定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定的温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数。即分配系数（kd）。 CA 在A相（动相）中的浓度KdCB 在B相（静相）中的浓度 物质分配 液液固液气液 有效分配系数某
21、一物质在A相中的总量Keff=某一物质在B相中的总量 对液液层析系统：CAVAKeff=-=Rd RvCBVBVAA相的体积 VBB相的体积RVA、B两相的体积比所以，Keff是RV的函数，溶质的有效分配系数可以调查两相的体积比而加以改变。 分离的先决条件：各种AA成分的分配系数有差异，差异越大，越容易分开。,3、 离子交换层析分离氨基酸,磺酸型阳离子交换树脂 树脂先用含Na的缓冲液处理成钠盐，且pH在2左右，将氨基酸混合液（pH2-3）上柱，氨基酸此时是阳离子，与树脂上的钠离子交换，被固定在树脂上。 作用力：（1）静电吸引，（2）氨基酸侧链与树脂基质(聚苯乙烯)的疏水作用力,Amino Acid Analysis Chromatogram,参考书,1沈同主编，生物化学（第二版）；高等教育出版社。 2陶蔚孙主编，蛋白质分子基础（第二版）；高等教育出版社，1995 3 Stryer L.Biochemistry.4th ed. New York :W.H.Freeman and Company,1995 4 Mathews C K , vam Holde K E. Biochemistry. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 2000,
