1、所以： 待测物浓度可以由检测其颜色深浅得到。,不同浓度，颜色深浅不一。,没有颜色？,间接： 通过生化反应生成有色物质，间接计算得到浓度。,双缩脲反应,分光光度法的原理基础：Lambert-Beer Law,，I 入射光及通过样品后的透射光强度； A吸光度(absorbance) ； C样品浓度； d光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度； k光被吸收的比例系数； T透射比，即透射光强度与入射光强度之比。简而言之，光被一定浓度介质吸收的比例与入射光的强度无关；在光程上每等厚层介质吸收相同比例值的光。,Lambert-Beer Law的适用范围：,(1) 入射光为平行单色光且垂直照射. (2) 吸光物质
2、为均匀非散射体系. (3) 吸光质点之间无相互作用. (4) 辐射与物质之间的作用仅限于光吸收,无荧光和光化学现象发生. (5) 待测物在一定溶度范围之内.,为什么需要平行单色光？,在非单色光的条件下，由于待测物质在各个波段下吸光系数 K 的不同，造成相关曲线也出现不同程度的偏离。,实际上，理论上的单色光是不存在的，我们所做的只能是让入射光的光谱带宽尽可能的小，要尽可能的靠近单色光。,为什么仅适用一定范围内？,Lambert-Beer Law在有解离、缔合、生成络合物或溶剂化等会对比尔定律产生偏离。,解离是偏离朗伯-比尔定律的主要化学因素，当溶液浓度（大于0.01mmol/L）改变，解离程度也
3、会发生变化，吸光度与浓度的比例关系便发生变化，导致偏离朗伯-比尔定律。,前分光模式,1、光源灯发出全波段光线,2、单色器将全波段光线分为某一波长的单色平行光,3、单色平行光经过反应杯溶液,4、光电信号接收器检测光线强度,后分光模式,5、光电信号检测各种光线强度,4、衍射光栅将出射光线分为不同波长的单色光,3、平行光经过反应杯溶液,1、光源灯发出全波段光线,2、光线经凸透镜整理成为不同波段平行光,双波长模式,在双波长模式下 A=A（主波长）-A（副波长） 较单波长的优点： 1、电压不稳定等环境影响下，由于主副波长都产生了相同程度的影响而被消除 2、一些常见的干扰因素如轻度溶血，将可以由于在主波长
4、和副波长具有相同的吸光度而被间接消除 3、双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响,在罗氏仪器上，待测物的12个波长的吸光度都被检测，选择设定中的2个波长进行计算。,分光光度法的分析类型,一，终点法 1-Point End Assay 2-Point End Assay 二，速率法 2-Point Rate Assay Rate Assay,1Point End：仅检测反应终点的吸光度,2-point end assay :检测2个点的吸光度，一点反应启动前样品空白的吸光度，另一点为反应启动后的吸光度。,2-Point End Ass
5、ay反应图：,2-Point Rate Assay：检测两个不同时间点之间的吸光度之差，除以时间差得到的变化率,1个或多个反应试剂 检测2个点吸光度用于计算 通过 Abs/min来计算检测项目的量,2-point Rate assay反应图,1个或多个反应试剂 通过最小二乘法计算反应曲线，得到待测物的量或活性,Rate A：一定时间连续多次测定反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，间接计算检测项目的量的方法。,Rate A反应图：,光度分析校准及报警,Calibration quality criteria校准限制界面,Utility Application screen,SD Li
6、mit(标准差限制) :实测吸光度和理论计算吸光度的差异 Duplicate limit (重复性限制):重复性限制,相对范围%和绝对范围 Sensitivity limit(灵敏度限制) :空白浓度和 c.f.a.s之间的单位浓度吸光度变化差异的最大值和最小值 S1 Absorbance Limit(空白限制) :试剂空白就是待测物浓度为0时的吸光度.,校准报告CHO,Std1,2双波长 检测吸光度差,Std1,2主波长 检测吸光度,校准报警,校准结果,K= (CFAS -0)/ (5848-1973) x 10000=1120,K = (CN Cb) (AN Ab),SD Limit(标准
7、差限制):常见校准校准失败的原因,校准的放置顺序可能有误（多个校准品） 单个校准品自动稀释后校准 加样精度问题 比色杯或光源灯老化 污染的或蒸发浓缩的校准品 混匀机构问题,Duplicate limit :重复性限制,检查同一个校准品的两次吸光度差异Abs1 - Ab2 校准的时候,每个校准品会重复做两次进行计算,原因： 如果是新试剂，检查试剂复溶及混匀情况 检查样品针和试剂针. 样品或试剂上有气泡 光源灯或比色杯老化 混匀不佳,Sensitivity limit(灵敏度限制),该数值标识出空白和 c.f.a.s之间的单位浓度吸光度变化差异的最大值和最小值 .在终点法的生化项目校准中，最小吸光
8、度变化是必须检测的标准 Sen:,Sensitivity limit(灵敏度限制):常见校准校准失败的原因,错误的校准品 蒸发浓缩或配制错误 旧的或污染的试剂 污染的空白校准品,空白和CFAS校准品的测得的吸光度值过于接近,校准失败,校准液（1）吸光度 Standard 1 Absorbance,S1 Abs 用于检查线性或非线性校准。报警用于指示第一点校准品吸光度是否超出范围。S1 Abs定义校准品1水平的上限和下限。用于检测试剂空白。,校准报警,DUP,SEN,S1 Abs Limit,Calib. Limit,造成生化校准报警的潜在可能原因,校准报警,如果校准失败，系统将自动使用之前有效
9、的校准曲线计算标本浓度。,生化项目检测常用显色指示系统,1，NAD+NADH（NADP+NADPH）指示系统 2，p-NP（磷酸对硝基苯酚）和 p-NA（硝基苯酚）指示系统 3，H2O2偶联的指示系统 4，抗原抗体反应指示系统，免疫比浊法 5，其它显色反应,1，NAD+NADH（NADP+NADPH）指示系统： 反应原理 ：NADH 和 NADPH 在 340nm 有特征性吸收峰，而 NAD+和 NADP+在 340nm无特征性吸收峰，利用其偶联的脱氢酶(工具酶)反应，根据 340nm 吸光度的变化，可以测定物质的浓度或 活性。 临床项目： ALT、AST、CK、LDH、CK-MB、-HBDH
10、 、 Glu（己糖激酶法）、UREA、NH4+ 、CO2 等 1.5.2.2. 举例说明 ALT的测定原理（IFCC） 试剂成分和反应公式： R1： NADH 、乳酸脱氢酶（LDH）； R2： L-丙氨酸 、-酮戊二酸 。 原理：NADH 的减少，引起 340nm 吸光度的下降，下降速率与 ALT 活性成正比(酶动力学法)。,2，p-NP（磷酸对硝基苯酚）和 p-NA（硝基苯酚）指示系统 反应原理：p-NP 和 p-NA 在 405nm 有特征性吸收峰，根据 405nm 吸光度的变化，可以测定物质的浓 度或活。 临床项目：ALP、ACP、r-GT、AMY 等。 举例说明 ： ALP的测定原理（
11、IFCC） 试剂成分和反应公式。 R1：AMP 缓冲液，镁离子，锌离子，PH10.44； R2：对硝基苯磷酸，防腐剂，PH8.5 原理：在镁离子和锌离子的存在下，碱性磷酸酶解离对硝基苯磷酸形成磷酸盐和对硝基苯酚， 引起 405nm 吸光度的上升，上升速率与 ALP 活性成正比（动力学法）。,3，H2O2偶联的指示系统 反应原理： H2O2在过氧化物酶的作用下，可使单一个或成对的无色的色素原氧化成有色的色素，导致某 一波长吸光度的增加，因此可用来测定物质的浓度或活性。 临床项目：过氧化物酶法 CHOL，GLU举例说明: GLU 过氧化物酶法的测定原理 R1：4-氨基安替吡啉 、抗坏血酸氧化酶 R
12、2：葡萄糖氧化酶（GOD）、过氧化物酶（PO D）、酚 。 测定原理：醌亚胺的生成，导致 500nm 吸光度的增加，增加的程度与 Glu 的含量成正比。,4，抗原抗体反应指示系统，免疫比浊法 反应原理： 特异性抗体与抗原(待测物质)在相应的缓冲环境下反应生成抗原抗体复合物，形成一定的浊 度，导致特定波长透光率的改变。在抗体过剩的前提下，改变程度与抗原浓度成正比。 临床项目： apoAI、apoB、Lp(a)、IgG、IgA、IgM、C3、 C4、CRP 等。,5，其它显色反应 TP 的反应原理 ： 蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物，导致 540nm 吸光度的增 加，增加
13、的程度与蛋白质的含量成正比。ALB 的反应原理： 在 pH4.2 环境中，溴甲酚绿在有非离子去垢剂聚氧乙烯月桂存在时，可与白蛋白形成蓝绿色复合物，导致 630nm 吸光度的增加，增加的程度与白蛋白的含量成正比。 其它的显色反应还有 Ca 和 Mg 等物质的测量方法，,反应系统,试剂系统,取样系统,光度测定系统,光度测定分析的流程,分析的流程,分析的流程,池冲洗单元位于反应盘右侧与后部。吸光度测定后，池冲洗单元进行反应池清洁、冲洗与干燥处理。 为确保反应池的光路性能良好，清洁过程中进行水充盈反应池的吸光度测定（池空白）并与前期的测定结果进行比较。池空白值可确保反应池的所有条件处于小的可耐受范围内。如果反应池未达到这些预设定限度，则无法用于常规检测中。,反应杯清洗过程：,
