1、1,第二章 基因工程（Gene engineering）,2,概 论,3,要 求 1、掌握基因工程的概念 2、掌握基因工程的基本过程 3、熟悉工具酶和载体类型及应用 4、熟悉原核、真核细胞转染、表 达的基本方法和类型。 5、熟悉基因工程产生的基础和过程 (科研思维与方法）。,6. 设计一个基因克隆的程序。,4,参考书,楚雍烈， 现代生物技术（西安交通大学讲义） Gene cloning, T.A. Brown. 基因工程原理，吴乃虎编著，科学出版社 基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版社 分子克隆实验指南，J. Sambtook, EF Frish, T Maniatis, 金冬雁，黎孟
2、枫等译，科学出版社。,5,生物技术的核心内容 基因工程 （Gene engineering） DNA重组（recombinant DNA technology） 基因操作（gene manipulation） 基因克隆（gene cloning） 分子克隆（molecular cloning） DNA克隆（DNA cloning） 基因修饰（gene modification）,6,基因工程的概念 基因工程的意义 基因工程的发展史 理论上的六大发现 技术上的六大进展 发展过程中的重大事件 基本步骤:两个水平，六个阶段,内容提要,7,一、基因工程的概念 定义： 人们按照预定设计，在体外对不同来源
3、DNA分子进行人工切割、连接、插入载体DNA分子，使遗传物质重新组合、改造，经转移、导入到原先不含有重组体的受体细胞，使之持续稳定繁殖、目的基因扩增、表达，获得人类所需的产品的工程。,8,With Restriction enzymes,With Restriction enzymes,with DNA ligase enzyme,(Genetic transformation),9,基因工程的基本内涵,基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，
4、供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。体外重建、基因转移和外源表达是重组DNA技术的三大环节。,10,基因工程的基本特征,基因工程有两个重要的特征：一是可把来自任何生物的基因重组和转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，因此可以实现按照人们的愿望，改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状；二是某一段DNA可在受体细胞内进行基因复制和表达，为准备大量纯化的DNA片段提供了可能，拓宽了分子生物学的研究领域。,11,基因工程的目的 （1）获得目的基因，DNA的提取、纯化和 DNA分子的克隆，建立文库。 （2）制备活性多肽产品：激素、细胞因 子、多肽药物疫苗等，诊断和防治 疾病。 （3）研究基
5、因结构、功能等,12,二、基因工程的重大意义 （1）重组DNA技术填平了生物种属间 不可逾越的鸿沟。 跨越天然物种屏障，将原核和真核生物、植物和动物，造福人类，在过去人们难以置信的事情，现在已成为现实。,13,（2）重组DNA技术缩短了进化时间。 遗传和变异是一对矛盾，遗传赋予生物种的稳定，变异赋予生物种的进化。在漫漫历史长河中，自然变异的进化时间是千万年，常规育种亦要几年；而重组DNA技术将进化时间大大缩短至几年。基因操作用于育种，将缩短进化时间，在解决全世界人民温饱问题上将发挥重要作用。,14,（3）重组DNA技术使人类能对生物 进行定向改造 重组DNA技术标志着人类控制和改造生物的历史已
6、进入一个新纪元。以重组DNA技术培育出抗真菌蔬菜为例，几丁质是真菌细胞的组分之一，几丁质酶能水解几丁质，美国科学家将几丁质酶基因导入西红柿、土豆、莴苣和甜菜中，正准备大田试验，这一技术将对蔬菜抗真菌感染具有重要意义。,15,（4）利用重组DNA技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制，从而拓 宽了分子生物学的研究领域。,16,（5）医学上应用更为广泛，涉及各领域 正常人类生命活动的分子机制； 人类各种疾病发生的分子机理； 人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、 肥胖、心血管疾病、传染病等病因 的查明、诊断、治疗和预防。 药物的研发和生产； 疾病模型的建立； 人类的营养
7、、健康、长寿和保健（亚健康）,17,18,本课程的地位：,现代科技革命,高新技术,生物技术,基因工程,基因克隆,19,基因工程不是发现，而是创造。,20,改变传统农业概念让植物生产人体蛋白质,发光的水稻,22,只 有 想 不 到 的,没 有 办 不 到 的,基因重组,23,第一节 基因工程的 发生与发展,24,一、基因工程诞生的理论基础20世纪中期分子遗传学理论的重大进展六大发现：1确定了生物遗传的物质基础是DNA肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化试验 噬菌体DNA转化实验,25, 1944年，美国微生物学家Avery证明基因就是DNA分子，提出 DNA是遗传信息的载体。,26,2DNA分子双螺旋
8、结构模型和半保留复制 DNA碱基配对规律和X衍射研究 DNA双螺旋结构模型。,28,3生物遗传的“中心法则”解决了遗传信息的流向和遗传性状的相互关系，揭示了生命遗传信息传递基本规律。自我复制，遗传信息由亲代传给子代；通过转录，遗传信息传给RNA；通过翻译，信息传给蛋白质和酶；基因型决定生物的表型。,DNA,RNA,protein,Replication,Replication,Transcription,Reverse Transcription,Translation,中心法则 （the central dogma）,31,4“操纵子”学说揭示了基因表达 和调控的概念。 基因组结构 基因分布
9、 基因表达 基因调控的原理 酶诱导的本质,32,5破译了全部生物遗传密码， 确定了它在生物界的通用 性，人类更加具体地了解 遗传信息表达规律。,33,遗传密码表,目 录,34,mRNA分子上从5至3的方向,每3个核苷酸构建一个密码子，编码某一特定氨基酸或作为蛋白质合成的起始、终止信号，称为三联体密码(triplet codon)，也称遗传密码子(genetic codon)。,解决了信息语言的对应关系。,35,终止密码 ： 翻译终止的密码，不代表任何氨基酸。有3个：UAA、UAG、UGA 代表氨基酸的密码：64 3 = 61 起始密码： AUG在mRNA起始部位时为起始密码。否，为Met密码。
10、,密码: 43 = 64,36,1) 通用性,遗传密码具有的特点,从原核生物到人类都使用同一套遗传密码。 已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。,2) 方向性,mRNA分子上由起始密码AUG开始，从53方向阅读密码子，直至终止密码。 决定蛋白质分子从N端C端的排列顺序。,37,3) 连续性,三联体密码连续性表现为中间无标点，连续阅读。mRNA开放阅读框架内发生一个或两个碱基插入或缺失，可引起移码突变(frameshift mutation)。,38,4) 简并性,目 录,即有多个密码子特异地破译同一个氨基酸 遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅对应一个密码子外，其余氨基酸均有一个以
11、上密码子为其编码。,39,5) 摆动性,tRNA上反密码子的第1位碱基与mRNA密码子的第3位碱基配对时，可以在一定范围内变动，即并不严格遵循碱基配对规律，这一现象称为摆动性。,40,6、生物进化，基因突变、获得的性状可以遗传到后代。,41,分子遗传学理论上的六大进展解决了生命现象的遗传物质基础（均是核酸）结构模型（同类构件、双螺旋）复制方式（相似的机制）遗传信息流动方向（共同的中心法则）遗传密码（共用一套相同的密码）表达和调控的机理（类同的方法）基因突变机理、意义（变异与进化）为基因工程技术的诞生典定了理论基础。 理论上的可行性。,42,二、分子遗传学新方法是基因工程的技术基础（六大技术）
12、首当其冲的是要解决： 如何自如地得到目的基因； 如何在体外改造基因，得到重组体； 如何在体外转移重组基因； 直到20世纪70年代中期，相继出现了几项关键性技术，梦想成真。,43,1工具酶的发现：DNA分子的切割和连接技术 1970年Smith发现了第一个型限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease，RE) Hinf对DNA分子有特异地切割作用。 （手术刀剪） 同年Khorana又发现了T4DNA连接酶（Ligase），能将DNA片段连接在一起。（缝纫机、浆糊） DNA、RNA聚合酶和反转录酶等合成酶。（复印机） 构成了一个研究DNA、 RNA分子的工具酶箱。,44,2
13、、DNA片段载体系统的构建目的基因、DNA片段不能复制，也易破坏。必须连到具有复制能力的DNA分子上。载体（vector) 是能携带外源DNA、能自我复制的小DNA分子。最早发现的是：质粒、噬菌体和病毒。,45,3、大肠杆菌受体细胞系统建立,体外获得的含目的基因或DNA片段的重组体，虽具有自我复制的本能，但没有原料、酶系统和生命活力。必须将其安全转移到宿主细胞才能进行增殖，赋予其“生命”。,46,4、大肠杆菌DNA转化体系建立 1970年发现氯化钙处理过的细胞易于吸收接纳外源DNA；1972年Cohen C报道，质粒DNA也能被大肠杆菌吸收。而后发现经过改造的质粒、噬菌体和病毒都可以携带目的D
14、NA片段和基因，经过转化大肠杆菌，建立该基因的无性繁殖系。,47,5、 DNA分析、鉴定技术酶切分析技术（核酸分辨仪）核酸分子杂交技术（核酸探测仪）序列分析（密码复读机）生物信息学（密码破译机）,48,6、DNA分离、纯化及鉴定技术凝胶电泳：Agarose, PAGE gel离心技术层析技术印迹技术: Southern blot,49,技术上的可行性 六大技术方法的建立 实际上的可操作性 材料、实验条件、时空条件、 经济条件和政策。 基础方面的基本条件（可能性+可行性+ 可操作性）具备，尚需人的科学创新思维+ 艰苦的实践。才能得到创新的发明、发现 和成果。,50,1970年， MIT 的科学家
15、率先提出在体外把不同来源的遗传物质进行重组的设想，但遭到反对，不予支持。没能进行试验。1972年， Boyer等在发现限制性核酸内切酶EcoR I 的基础上，开始了实验。,51,1972年Berg等人使用EcoRI在体外对猴病毒SV40的DNA和噬菌体的DNA分别酶消化，再用T4DNA连接酶将两种片段连接起来，得到SV40和 DNA的重组杂种DNA分子，率先完成了世界上第一次成功的DNA体外不同物种之间的DNA重组实验（片段重组）。,基因工程的大胆尝试,52,基因工程的诞生,1980年Nobel化学奖,1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重组实验。,Berg的开创性实验,
16、53,1973 年 Cohen 成功地进行了另一个体外DNA重组实验。分别把编码卡那霉素和四环素抗性基因的两种质粒酶切、连接，再将这种重组的DNA分子转化大肠杆菌，某些转化菌落具有既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗体特性。他的工作是世界上第一次成功的基因克隆实验，并有基因表达及新的表型。标志着基因工程的诞生。,54,pSC101,pR6-5,抗四环素,抗卡那霉素,EcoRI,抗卡那霉素基因,DNA连接酶,重组DNA分子,55,培养平皿,大肠杆菌,56,后来又把非洲爪蟾核糖体基因片段同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因表达实验。,57,197
17、4年，首次实现异源间基因重组。 把小鼠的生长激素抑素基因在大肠杆菌中表达。,58,1976年，世界上第一个基因公司在美国成立，“Genetech”注册登记，意味着基因工程的实际应用已跨入商业运作的门槛。 生物工程从此进入产业化。,59,1978年，人类的第一个基因被克隆。人生长激素抑素基因被重组到大肠杆菌的质粒DNA中 。 1978-1979胰岛素基因在大肠杆菌中表达。,60,1982年 1、把大白鼠的生长激素基因克隆、转移到小鼠的受精卵内， 第一个转基因超级鼠诞生。 2、人胰岛素基因的cDNA 被克隆、成功表达和开始成为商品上市。 基因产品有效益、开始新兴产业。,61,三、基因工程的基本步骤
18、 两个水平，六个阶段,62,基因工程包括分子和细胞两个水平操作 分子水平操作指的是基因重组、克隆和表达的设计与重组体构建（即重组DNA技术）； 细胞水平操作则指转化、筛选和培养工程菌或细胞以及表达产物的分离纯化过程。,63,1分子水平操作阶段： 获得含目的基因的重组体分子（亦称重组子）。 本阶段的操作有三个主要环节： （1）分离：提取、分离含目的基因的DNA分子和载体DNA分子，在分离提取过程中，注意质、量，减少损伤。 （2）切割：选择合适的RE工具酶，分别对外源目的DNA分子和载体DNA分子进行酶解切割。 （3）连接：用DNA连接酶，将目的基因与载体在体外连接为一个重组DNA分子，并进行鉴定
19、。,64,分离：目的基因的获取,需要克隆的DNA片段：,化学合成法,cDNA文库 基因组DNA文库,聚合酶链式反应,65,载体DNA的选择,功能： 为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。 为目的基因提供在受体细胞中复制或整合能力。 为目的基因提供在受体细胞中的表达能力。,66,限制性内切酶酶切,切割：,内切酶,连接酶,连接：,DNA连接酶,67,2.细胞水平操作阶段： 把含目的基因的重组体导入受体细菌或受体细 胞，赋予其“生命”让其表达，获得产品。 本阶段的操作也有三个主要环节。 （1）转移：利用DNA转移技术，把构建的重组体导入到受体菌或受体细胞中，获得工程菌或工程细胞。 （2）筛选：利用核
20、酸杂交，酶切分析、PCR和表型特征等技术，筛选出已克隆化的工程菌/细胞。 （3）表达：大量培养含重组体的工程菌/细胞，诱导其表达，并对表达产物进行鉴定，提取和纯化。,68,重组体的转化,受体细胞,转移：,含氨苄平板,重组质粒,感受态,重组体,69,重组体克隆的筛选与鉴定,筛选：,宿主细胞,70,外源基因在宿主细胞中的表达,重组子,目的基因的mRNA,表达蛋白质,大肠杆菌（ E.coli）工程细胞,表达：,目的基因表达产物的检测,重组DNA操作一般步骤：,（1）分离：提取和获得目的基因和载体DNA； （2）切割：分别对目的基因和载体DNA酶切； （3）连接：目的基因与载体连接，形成新的重组 DN
21、A分子； （4）转化：用重组DNA分子转化受体细胞； （5）筛选：能在受体细胞中复制和遗传；对转化子筛选和鉴定； （6）表达：对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。,基因载体,目的基因,质粒 噬菌体 病毒,PCR cDNA 人工合成 基因文库,限制性内切酶,有切口的载体,有切口的目的基因,DNA连接酶,重组体,转化 转染 体外包装,带重组体的宿主细胞,表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法,目的基因的表达,73,图2-1 基因工程技术流程图,74,基因工程表达依据的基本原理,提高外源基因的剂量分子遗传学原理,筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子
22、、增强子、操作子、终止子、上游调控序列等分子生物学原理,修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序列、mRNA非编码区、密码子等分子生物学原理 基因工程菌（微型生物反应器）增殖及稳定生产生化工程学原理,75,基因工程的支撑技术,核酸凝胶电泳技术,核酸分子杂交技术,细菌转化转染技术,DNA序列分析技术,寡核苷酸合成技术,基因定点突变技术,聚合酶链反应（PCR）技术,76,运输工具： 细菌质粒 病毒 DNA操作技术 纯化DNA 剪切DNA分子 分析DNA片段大小 连接DNA分子 受体细胞的制备 将DNA转入受体细胞并扩增 重组子的筛选和鉴定 目的基因的表达,77,Thank You for Your Attention!,谢 谢,
